식물 숙주에서 딱정벌레 벡터의 바이러스 및 타액 단백질 검출
Summary
이 프로토콜은 식물 숙주를 사용하여 딱정벌레의 타액 단백질을 검출하고 딱정벌레 벡터에 의해 방출되는 식물 바이러스 단백질을 검출하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
곤충 벡터는 농업적으로 중요한 많은 식물 바이러스를 수평으로 전염시킵니다. 식물 바이러스의 절반 이상이 입 부분을 뚫고 빠는 반구 곤충에 의해 전염됩니다. 바이러스 전파 동안 곤충 타액은 타액 벡터 바이러스와 곤충 단백질이 곤충에서 식물 숙주로 식물의 면역 반응을 유발하거나 억제하기 때문에 바이러스 벡터 숙주를 연결합니다. 타액 단백질의 식별 및 기능 분석은 아르보 바이러스-숙주 상호 작용 연구 분야에서 새로운 초점 영역이 되고 있습니다. 이 프로토콜은 식물 숙주를 사용하여 딱정벌레의 타액에서 단백질을 검출하는 시스템을 제공합니다. 벼난쟁이 바이러스(RDV)에 감염된 딱정벌레 벡터 Nephotettix cincticeps 가 그 예입니다. N. cincticeps 의 타액에 의해 매개된 RDV의 비텔로제닌과 주요 외부 캡시드 단백질 P8은 N. cincticeps 가 먹는 벼에서 동시에 검출될 수 있습니다. 이 방법은 곤충 먹이 후 식물 숙주에 일시적으로 남아 있는 타액 단백질을 테스트하는 데 적용할 수 있습니다. 이 검출 시스템은 헤미프테란-바이러스-식물 또는 헤미프테란-식물 상호작용 연구에 도움이 될 것으로 믿어집니다.
Introduction
근본적인 문제인 아르보 바이러스의 벡터 숙주 전파 방식은 생물학의 최전선에 있습니다. 농업적으로 중요한 많은 식물 바이러스는 곤충 매개체에 의해 수평으로 전염된다1. 식물 바이러스의 절반 이상이 진딧물, 흰파리, 딱정벌레, 식물벌레 및 총채벌레를 포함한 반구 곤충에 의해 매개됩니다. 이 곤충들은 식물 바이러스를 효율적으로 전염시킬 수 있는 뚜렷한 특징을 가지고 있다1. 그들은 구멍을 뚫고 빨아들이는 입 부분을 가지고 있으며 체관부와 목부에서 수액을 먹고 타액을 분비합니다 1,2,3,4. 기술의 개발과 개선으로 타액 성분의 식별 및 기능 분석은 집중 연구의 새로운 초점이 되고 있습니다. 타액에 있는 알려진 타액 단백질에는 펙티에스테라제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타제, 폴리페놀 산화효소 및 수크라제와 같은 수많은 효소가 포함되며, 그 중에서도 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 타액의 단백질은 또한 숙주 방어 반응을 유발하여 곤충의 성능을 변화시키는 유도인자와 숙주 방어를 억제하여 곤충 적합성을 향상시키는 이펙터 및 숙주 병리학적 반응을 유도하는 성분을 포함한다14,15,16,17. 따라서 타액 단백질은 곤충과 숙주 사이의 의사 소통에 필수적인 물질입니다. 바이러스가 전염되는 동안 피어싱을 빨아들이는 독성 곤충의 타액선에서 분비되는 타액에는 바이러스 단백질도 포함되어 있습니다. 바이러스 성분은 타액의 흐름을 이용하여 곤충에서 식물 숙주로 방출합니다. 따라서 곤충 타액은 바이러스-벡터-숙주 삼영양 상호작용을 연결합니다. 독성 곤충이 분비하는 타액 단백질의 생물학적 기능을 조사하면 바이러스-벡터-숙주의 관계를 이해하는 데 도움이 됩니다.
동물 바이러스의 경우 모기의 타액이 웨스트 나일 바이러스 (WNV)와 뎅기열 바이러스 (DENV)의 전염 및 병원성을 매개한다고보고되었습니다. 타액 단백질 AaSG34는 뎅기열-2 바이러스 복제 및 전파를 촉진하는 반면, 타액 단백질 AaVA-1은 자가포식을 활성화하여 DENV 및 지카 바이러스(ZIKV) 전파를 촉진합니다18,19. 모기의 타액 단백질 D7은 DENV 비리온 및 재조합 DENV 외피 단백질20과의 직접적인 상호작용을 통해 시험관 내 및 생체 내에서 DENV 감염을 억제할 수 있습니다. 식물 바이러스에서 베고모바이러스 토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)는 식물 숙주의 WRKY33 매개 면역을 억제하는 흰파리 타액 단백질 Bsp9를 유도하여 흰파리의 선호도와 성능을 증가시켜 결국 바이러스21의 전파를 증가시킵니다. 곤충 타액 단백질이 식물 숙주에서 수행하는 역할에 대한 연구가 동물 숙주보다 뒤쳐져 있기 때문에 식물 숙주에서 타액 단백질을 검출하는 안정적이고 신뢰할 수 있는 시스템이 시급히 필요합니다.
벼 왜소 바이러스 (RDV)로 알려진 식물 바이러스는 딱정벌레 Nephotettix cincticeps (Hemiptera : Cicadellidae)에 의해 높은 효율과 지속적으로 번식하는 방식으로 전염됩니다22,23. RDV는 곤충 매개체에 의해 전염되는 것으로 처음 보고되었으며 아시아에서 벼의 심각한 질병을 유발합니다24,25. 비리 온은 icosahedral 및 이중층 구형이며, 외층은 P8 외부 캡시드 단백질22를 함유한다. N. cincticeps에서 RDV의 순환 전파 기간은 14 일 26,27,28,29,30입니다. RDV가 타액선에 도착하면 비리온은 엑소사이토시스와 유사한 메커니즘을 통해 타액선의 타액에 저장된 공동으로 방출됩니다(23). 비텔로제닌(Vg)은 암컷 곤충의 난모세포 발달에 필수적인 난황 단백질 전구체입니다31,32,33. 대부분의 곤충 종은 약 220 kDa의 전구체 단백질을 암호화하는 6-7 kb의 적어도 하나의 Vg 전사체를 가지고 있습니다. Vg의 단백질 전구체는 일반적으로 난소에 들어가기 전에 큰 (140 내지 190 kDa) 및 작은 (<50 kDa) 단편으로 절단될 수 있다18,19. 이전의 단백질체 분석에서는 딱정벌레 Recilia dorsalis의 분비된 타액에서 Vg에서 파생된 펩타이드의 존재가 밝혀졌지만 그 기능은 알려져 있지 않습니다(미공개 데이터). 식물 호퍼로부터 경구로 분비되는 Vg가 식물34의 방어를 손상시키는 이펙터로 기능한다는 것이 새로보고되었습니다. N. cincticeps의 Vg가 타액 흐름으로 식물 숙주에게 방출 될 수 있는지, 그리고 식물에서 식물 방어를 방해하는 역할을 할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. N. cincticeps가 Vg와 같은 타액 단백질을 이용하여 식물 방어를 억제하거나 활성화하는지 여부를 확인하기 위해 첫 번째 단계는 먹이를 주는 동안 식물에 방출되는 단백질을 식별하는 것입니다. 식물에 존재하는 타액 단백질을 식별하는 방법을 이해하는 것은 타액 단백질의 기능과 Hemiptera와 식물 간의 상호 작용을 설명하는 데 잠재적으로 필수적입니다.
여기에 제시된 프로토콜에서, N. cincticeps 는 곤충 먹이를 통해 도입된 식물 숙주에서 타액 단백질의 존재를 조사하는 방법을 제공하기 위한 예로서 사용된다. 이 프로토콜은 주로 타액 단백질의 수집 및 검출에 대해 자세히 설명하며 대부분의 반구에 대한 추가 조사에 도움이 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
꿰뚫는 곤충의 침샘에서 직접 분비되는 타액은 숙주 조직과 벡터의 왕국 간 생물학적 인자를 숙주로 미리 소화하고 해독하기 때문에 중추적인 역할을 합니다 1,3,4. 유도 인자, 이펙터 및 작은 RNA를 포함한 교차 왕국 생물학적 요인은 곤충-숙주 통신에 중요합니다14,15,16<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (31772124 및 31972239)과 복건 농업 임업 대학 (보조금 KSYLX014)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
Referências
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