植物宿主におけるヨコバイベクターのウイルスおよび唾液タンパク質の検出
Summary
このプロトコルは、植物宿主を使用して、ヨコバイの唾液タンパク質およびヨコバイベクターによって放出される植物ウイルスタンパク質を検出する方法を示しています。
Abstract
昆虫ベクターは、農業上重要な多くの植物ウイルスを水平に感染させます。植物ウイルスの半分以上は、口の部分を刺す半翅目昆虫によって伝染します。ウイルス感染中、唾液ベクターウイルスと昆虫タンパク質が昆虫から植物宿主への植物の免疫応答を誘発または抑制するため、昆虫の唾液はウイルスベクター宿主を橋渡しします。唾液タンパク質の同定と機能解析は、アルボウイルスと宿主の相互作用の研究分野における新たな焦点となりつつあります。このプロトコルは、植物宿主を使用してヨコバイの唾液中のタンパク質を検出するシステムを提供します。ヨコバイベクターネフォ テティックス・シンクティセプス は、イネ矮性ウイルス(RDV)に感染した例として役立つ。ニテロゲニンと、 N. cincticeps の唾液によって媒介されたRDVの主要な外側キャプシドタンパク質P8は、 N. cincticeps が餌とするイネで同時に検出することができます。この方法は、昆虫の餌付け後に植物宿主に一過性に保持される唾液タンパク質の試験に適用できます。この検出システムは、半翅目 – ウイルス – 植物または半翅目 – 植物相互作用の研究に役立つと考えられている。
Introduction
根本的な問題であるアルボウイルスのベクター宿主感染様式は、生物科学の最前線にあります。農業上重要な多くの植物ウイルスは、昆虫媒介動物によって水平に伝染します1。植物ウイルスの半分以上は、アブラムシ、コナジラミ、ヨコバイ、ウンカ、アザミウマなどの半翅目昆虫によって媒介されています。これらの昆虫は、植物ウイルスを効率的に感染させることを可能にする明確な特徴を持っています1。彼らは穿孔吸引口器を持ち、師部と木部からの樹液を食べ、唾液を分泌します1,2,3,4。技術の開発と改善に伴い、唾液成分の同定と機能分析は、集中的な研究の新たな焦点になりつつあります。唾液中の既知の唾液タンパク質には、ペクチネステラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、スクラーゼなどの多数の酵素が含まれます5,6,7,8,9,10,11,12,13 .唾液中のタンパク質には、宿主防御応答を誘発し、それによって昆虫の性能を変化させるエリシター、および昆虫の適応度を高める宿主防御を抑制するエフェクターおよび宿主病理学的応答を誘導する成分も含まれる14,15,16,17。したがって、唾液タンパク質は昆虫と宿主の間のコミュニケーションに不可欠な物質です。ウイルスの伝染中、穿刺吸引ウイルス性の昆虫の唾液腺から分泌される唾液にもウイルスタンパク質が含まれています。ウイルス成分は唾液の流れを利用して昆虫から植物宿主に放出します。したがって、昆虫の唾液は、ウイルス-ベクター-宿主の三栄養相互作用を橋渡しします。ウイルス性昆虫が分泌する唾液タンパク質の生物学的機能を調査することは、ウイルス-ベクター-宿主の関係を理解するのに役立ちます。
動物ウイルスの場合、蚊の唾液がウエストナイルウイルス(WNV)とデングウイルス(DENV)の伝染と病原性を媒介することが報告されています。唾液タンパク質AaSG34はデング熱ウイルスの複製と伝播を促進し、唾液タンパク質AaVA-1はオートファジーを活性化することによりDENVおよびジカウイルス(ZIKV)の伝播を促進します18,19。蚊の唾液タンパク質D7は、DENVビリオンおよび組換えDENVエンベロープタンパク質20との直接相互作用を介して、インビトロおよびインビボでDENV感染を阻害することができる。植物ウイルスでは、ベゴモウイルストマト黄葉カールウイルス(TYLCV)は、植物宿主のWRKY33を介した免疫を抑制するコナジラミ唾液タンパク質Bsp9を誘導して、コナジラミの嗜好と性能を高め、最終的にウイルスの感染を増加させます21。昆虫の唾液タンパク質が植物宿主で果たす役割の研究は動物宿主の研究に遅れをとっており、植物宿主中の唾液タンパク質を検出するための安定した信頼性の高いシステムが緊急に必要とされています。
イネ矮性ウイルス(RDV)として知られる植物ウイルスは、ヨコバイネフォテティクス・シンクティセプス(半翅目:Cicadellidae)によって高効率で持続的に増殖して伝染します22,23。RDVは昆虫媒介動物によって伝染し、アジアでイネの重篤な病気を引き起こすことが最初に報告されました24,25。ビリオンは二十面体で二重層の球状であり、外層はP8外側キャプシドタンパク質22を含む。N. cincticepsにおけるRDVの循環伝達期間は14日26,27,28,29,30である。RDVが唾液腺に到達すると、ビリオンはエキソサイトーシス様機構を介して唾液腺の唾液貯蔵空洞に放出される23。ビテロゲニン(Vg)は、雌昆虫の卵母細胞発生に必須の卵黄タンパク質前駆体です31、32、33。ほとんどの昆虫種は、約220kDaの前駆タンパク質をコードする6〜7kbの少なくとも1つのVg転写産物を有する。Vgのタンパク質前駆体は、通常、卵巣に入る前に、大きな断片(140〜190 kDa)と小さな断片(<50 kDa)に切断することができます18,19。これまでのプロテオミクス解析では、ヨコバイの分泌唾液中にVg由来のペプチドが存在することが明らかになったが、その機能は不明である(未発表データ)。ウンカから経口分泌されるVgが、植物の防御を損傷するエフェクターとして機能することが新たに報告されている34。N. cincticepsのVgも唾液流で植物宿主に放出され、植物防御を妨害する役割を果たすことができるかどうかは不明です。N. cincticepsがVgなどの唾液タンパク質を利用して植物の防御を阻害または活性化するかどうかに対処するための最初のステップは、摂食中に植物に放出されるタンパク質を特定することです。植物中に存在する唾液タンパク質の同定方法を理解することは、唾液タンパク質の機能や半翅目と植物の相互作用を説明するために不可欠である可能性があります。
ここで提示されたプロトコルでは、 N. cincticeps は、昆虫の摂食によって導入された植物宿主における唾液タンパク質の存在を調べる方法を提供するための例として使用されています。このプロトコルは、主に唾液タンパク質の収集と検出について詳しく説明しており、ほとんどの半翅目のさらなる調査に役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
刺し吸う昆虫の唾液腺から直接分泌される唾液は、宿主組織とベクターのクロスキングダム生物学的因子を宿主に事前に消化して解毒するため、極めて重要な役割を果たします1,3,4。エリシター、エフェクター、低分子RNAなどの異性界の生物学的因子は、昆虫と宿主のコミュニケーションにとって重要です14,1…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(31772124および31972239)および福建農林大学(Grant KSYLX014)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
Referências
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