Bitki Konağındaki Bir Yaprakçık Vektörünün Virüs ve Tükürük Proteinlerinin Tespiti
Summary
Bu protokol, yaprak haznesinin tükürük proteinlerini ve yaprak haznesi vektörleri tarafından salınan bitki viral proteinlerini tespit etmek için bitki konağının nasıl kullanılacağını göstermektedir.
Abstract
Böcek vektörleri yatay olarak tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsünü iletir. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, delici emici ağız kısımlarına sahip hemipteran böcekler tarafından bulaşır. Viral bulaşma sırasında, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçıyı köprüler, çünkü tükürük vektörleri virüsleri ve böcek proteinleri, bitkilerin böceklerden bitki konakçılarına bağışıklık tepkisini tetikler veya bastırır. Tükürük proteinlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri, arbovirüs-konakçı etkileşimlerinin araştırma alanında yeni bir odak alanı haline gelmektedir. Bu protokol, bitki konağını kullanarak yaprakçıkların tükürüğündeki proteinleri tespit etmek için bir sistem sağlar. Pirinç cüce virüsü (RDV) ile enfekte olmuş yaprak vektörü Nephotettix cincticeps buna bir örnek teşkil eder. N. cinctiacps’ın tükürüğü tarafından vektörleştirilen RDV’nin vitellogenin ve majör dış kapsid proteini P8, N. cinctiacps’ın beslendiği pirinç bitkisinde aynı anda tespit edilebilir. Bu yöntem, böcek beslemesinden sonra bitki konakçısında geçici olarak tutulan tükürük proteinlerini test etmek için geçerlidir. Bu tespit sisteminin hemipteran-virüs-bitki veya hemipteran-bitki etkileşimlerinin incelenmesine fayda sağlayacağına inanılmaktadır.
Introduction
Temel bir problem olan arbovirüslerin vektör-konakçı iletim modu, biyoloji biliminin sınırındadır. Tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsü, böcek vektörleri1 tarafından yatay olarak bulaşır. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, yaprak bitleri, beyaz sinekler, yaprakçıklar, planthoppers ve thrips dahil olmak üzere hemipteran böcekler tarafından vektörleştirilir. Bu böcekler, bitki virüslerini verimli bir şekilde iletmelerini sağlayan farklı özelliklere sahiptir1. Delici emici ağız kısımlarına sahiptirler ve floem ve ksilemden gelen özsu ile beslenirler ve tükürüklerini 1,2,3,4 salgılarlar. Tekniklerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesiyle, tükürük bileşenlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri yoğun araştırmaların yeni bir odağı haline gelmektedir. Tükürükteki bilinen tükürük proteinleri, diğerlerinin yanı sıra pektinesteraz, selülaz, peroksidaz, alkali fosfataz, polifenol oksidaz ve sukraz gibi çok sayıda enzim içerir 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Tükürükteki proteinler ayrıca konakçı savunma tepkisini tetikleyen, böylece böceklerin performansını değiştiren elisitörleri ve konakçı savunmasını baskılayan efektörleri içerir, bu da böcek uygunluğunu arttırır ve konakçı patolojik yanıtlarını indükleyen bileşenler14,15,16,17. Bu nedenle, tükürük proteinleri böcekler ve konakçılar arasındaki iletişim için hayati öneme sahip malzemelerdir. Virüslerin bulaşması sırasında, delici emici virülifer böceklerin tükürük bezleri tarafından salgılanan tükürük de viral proteinler içerir. Viral bileşenler, onları böcekten bitki konağına serbest bırakmak için tükürük akışını kullanır. Bu nedenle, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçı tritrofik etkileşimini köprüler. Virülifer böcekler tarafından salgılanan tükürük proteinlerinin biyolojik fonksiyonunun araştırılması, virüs-vektör-konakçı ilişkisinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Hayvan virüsleri için, sivrisineklerin tükürüğünün Batı Nil virüsü (WNV) ve Dang virüsünün (DENV) bulaşmasına ve patojenitesine aracılık ettiği bildirilmektedir. Tükürük proteini AaSG34, dang humması-2 virüsü replikasyonunu ve iletimini teşvik ederken, tükürük proteini AaVA-1, otofajiyi aktive ederek DENV ve Zika virüsü (ZIKV) bulaşmasını teşvik eder18,19. Sivrisineklerin tükürük proteini D7, DENV viryonları ve rekombinant DENV zarf proteini20 ile doğrudan etkileşim yoluyla in vitro ve in vivo DENV enfeksiyonunu inhibe edebilir. Bitki virüslerinde, begomovirüs domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV), beyaz sineklerin tercihini ve performansını arttırmak için bitki konağının WRKY33 aracılı bağışıklığını baskılayan beyaz sinek tükürük proteini Bsp9’u indükler ve sonunda virüslerin bulaşmasını arttırır21. Böcek tükürük proteinlerinin bitki konakçılarında oynadığı rol üzerine yapılan çalışmalar, hayvan konakçılarınınkinin gerisinde kaldığından, bitki konakçılarındaki tükürük proteinlerini tespit etmek için kararlı ve güvenilir bir sisteme acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Pirinç cüce virüsü (RDV) olarak bilinen bitki virüsü, yaprak haznesi Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) tarafından yüksek verimlilikle ve sürekli çoğalan bir şekilde bulaşır22,23. RDV’nin ilk olarak bir böcek vektörü tarafından bulaştığı ve Asya’da ciddi bir pirinç hastalığına neden olduğu bildirilmiştir24,25. Virion ikosahedral ve çift katmanlı küreseldir ve dış tabaka P8 dış kapsid proteini22’yi içerir. N. cinctiaceps’te RDV’nin dolaşım süresi 14 gün 26,27,28,29,30’dur. RDV tükürük bezlerine ulaştığında, virionlar ekzositoz benzeri bir mekanizma 23 aracılığıyla tükürük bezlerindeki tükürük depolanan boşluklara salınır. Vitellogenin (Vg), dişi böceklerde oosit gelişimi için gerekli olan yumurta sarısı proteini öncüsüdür31,32,33. Çoğu böcek türü, yaklaşık 220 kDa’lık bir öncü proteini kodlayan 6-7 kb’lik en az bir Vg transkriptine sahiptir. Vg’nin protein öncülleri genellikle yumurtalık 18,19’a girmeden önce büyük (140 ila 190 kDa) ve küçük (<50 kDa) parçalara ayrılabilir. Önceki proteomik analiz, Vg’den türetilen peptitlerin, işlevleri bilinmemekle birlikte, yaprakçık Recilia dorsalis’in salgılanan tükürüğünde varlığını ortaya koymuştur (yayınlanmamış veriler). Bitkilerden ağızdan salgılanan Vg’nin, bitkilerin savunmalarına zarar vermek için bir efektör olarak işlev gördüğü yeni bildirilmiştir34. N. cinctiaces’in Vg’sinin tükürük akışıyla bitki konakçısına da salınıp bırakılamayacağı ve daha sonra bitki savunmasına müdahale etmek için bitkide rol oynayıp oynayamayacağı bilinmemektedir. N. cinctiaceps’in bitki savunmasını inhibe etmek veya aktive etmek için Vg gibi tükürük proteinlerini kullanıp kullanmadığını ele almak için ilk adım, beslenme sırasında bitkiye salınan proteinleri tanımlamaktır. Bitkide bulunan tükürük proteinlerini tanımlama yöntemini anlamak, tükürük proteinlerinin işlevini ve Hemiptera ile bitkiler arasındaki etkileşimleri açıklamak için potansiyel olarak gereklidir.
Burada sunulan protokolde, N. cinctiacps , böcek besleme yoluyla tanıtılan bitki konakçısında tükürük proteinlerinin varlığını incelemek için bir yöntem sağlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Protokol öncelikle tükürük proteinlerinin toplanmasını ve tespitini detaylandırır ve çoğu hemipteran üzerinde daha fazla araştırma için yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Delici emici böceklerin tükürük bezleri tarafından doğrudan salgılanan tükürük çok önemli bir rol oynar, çünkü konakçı dokuları ve vektörlerin krallıklar arası biyolojik faktörlerini konakçılara önceden sindirir ve detoksifiye eder 1,3,4. Elicitors, efektörler ve küçük RNA dahil olmak üzere krallıklar arası biyolojik faktörler, böcek-konakçı iletişimi için kritik öneme sahiptir<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31772124 ve 31972239) ve Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi’nden (Grant KSYLX014) gelen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
Referências
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. , (2003).
- Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps. Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).
- Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae). Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).
- Miles, P. W. Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds. Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).
- Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. Phenol oxidising enzymes in the grain aphid’s saliva. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).
- Miles, P. W., Peng, Z. Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids. Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).
- Will, T., van Bel, A. Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).
- Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments. Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).
- Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).
- Funk, C. J. Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant-insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment. Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. , (2018).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant–insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Sun, P., et al. A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy. Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).
- Sri-In, C., et al. A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).
- Conway, M. J., et al. Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection. Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).
- Wang, N., et al. A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).
- Omura, T., Yan, J. Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors. Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).
- Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus. Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).
- Fukushi, T. Further studies on the dwarf disease of rice plant. Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).
- Miyazaki, N., et al. The functional organization of the internal components of rice dwarf virus. Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).
- Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes. Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).
- Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector. Virology Journal. 12, 211 (2015).
- Chen, Q., et al. Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector. Virus Research. 210, 54-61 (2015).
- Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector. Scientific Reports. 7, 38563 (2017).
- Wei, T., et al. The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures. Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).
- Mao, Q., et al. Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development. mBio. 11 (6), 01142 (2020).
- Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
- Sappington, T. W., Raikhel, A. S. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).
- Ji, R., et al. Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses. New Phytologist. , (2021).
