Detección de virus y proteínas salivales de un vector saltahojas en el huésped vegetal
Summary
Este protocolo demuestra cómo usar la planta huésped para detectar proteínas salivales de saltahojas y proteínas virales vegetales liberadas por vectores saltahojas.
Abstract
Los insectos vectores transmiten horizontalmente muchos virus vegetales de importancia agrícola. Más de la mitad de los virus de las plantas son transmitidos por insectos hemípteros que tienen piezas bucales perforadoras y chupadoras. Durante la transmisión viral, la saliva del insecto une el virus-vector-huésped porque los vectores de saliva los virus, y las proteínas del insecto, desencadenan o suprimen la respuesta inmune de las plantas de los insectos a los huéspedes de las plantas. La identificación y el análisis funcional de las proteínas salivales se están convirtiendo en una nueva área de enfoque en el campo de investigación de las interacciones arbovirus-huésped. Este protocolo proporciona un sistema para detectar proteínas en la saliva de los saltahojas utilizando la planta huésped. El vector saltahojas Nephotettix cincticeps infectado con el virus enano del arroz (RDV) sirve como ejemplo. La vitelogenina y la principal proteína P8 de la cápside externa del RDV vectorizada por la saliva de N. cincticeps se pueden detectar simultáneamente en la planta de arroz de la que se alimenta N. cincticeps. Este método es aplicable para probar las proteínas salivales que se retienen transitoriamente en el huésped de la planta después de la alimentación de insectos. Se cree que este sistema de detección beneficiará el estudio de las interacciones hemíptero-virus-planta o hemíptero-planta.
Introduction
El modo de transmisión vector-huésped de los arbovirus, un problema fundamental, está en la frontera de la ciencia biológica. Muchos virus vegetales de importancia agrícola son transmitidos horizontalmente por insectos vectores1. Más de la mitad de los virus de las plantas son vectorizados por insectos hemípteros, incluidos pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips. Estos insectos tienen características distintivas que les permiten transmitir eficientemente los virus de las plantas1. Poseen piezas bucales perforadoras-chupadoras y se alimentan de la savia del floema y el xilema, y secretan su saliva 1,2,3,4. Con el desarrollo y la mejora de las técnicas, la identificación y el análisis funcional de los componentes salivales se están convirtiendo en un nuevo foco de investigación intensiva. Las proteínas salivales conocidas en la saliva incluyen numerosas enzimas, como pectinesterasa, celulasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, polifenol oxidasa y sacarasa, entre otras 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Las proteínas en la saliva también incluyen elicitores que desencadenan la respuesta de defensa del huésped, alterando así el rendimiento de los insectos, y efectores que suprimen la defensa del huésped, lo que mejora la aptitud del insecto y los componentes que inducen respuestas patológicas del huésped14,15,16,17. Por lo tanto, las proteínas de la saliva son materiales vitales para la comunicación entre insectos y huéspedes. Durante la transmisión de virus, la saliva secretada por las glándulas salivales de los insectos virulíferos penetrantes y chupadores también contiene proteínas virales. Los componentes virales utilizan el flujo de saliva para liberarlos del insecto al huésped de la planta. Por lo tanto, la saliva del insecto une la interacción tritrófica virus-vector-huésped. Investigar la función biológica de las proteínas de la saliva secretadas por insectos virulíferos ayuda a comprender la relación virus-vector-huésped.
Para los virus animales, se informa que la saliva de los mosquitos media la transmisión y patogenicidad del virus del Nilo Occidental (VNO) y el virus del dengue (DENV). La proteína salival AaSG34 promueve la replicación y transmisión del virus del dengue-2, mientras que la proteína salival AaVA-1 promueve la transmisión del virus DENV y Zika (ZIKV) mediante la activación de la autofagia18,19. La proteína salival D7 de los mosquitos puede inhibir la infección por DENV in vitro e in vivo a través de la interacción directa con los viriones DENV y la proteína20 de la envoltura DENV recombinante. En virus vegetales, el begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induce la proteína salival de mosca blanca Bsp9, que suprime la inmunidad mediada por WRKY33 de la planta huésped, para aumentar la preferencia y el rendimiento de las moscas blancas, aumentando eventualmente la transmisión de virus21. Debido a que los estudios sobre el papel que desempeñan las proteínas salivales de los insectos en los huéspedes de las plantas se han quedado atrás de los de los huéspedes animales, se requiere urgentemente un sistema estable y confiable para detectar las proteínas salivales en los huéspedes de las plantas.
El virus vegetal conocido como virus enano del arroz (RDV) es transmitido por el saltahojas Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) con alta eficiencia y de manera persistentemente propagativa22,23. Se informó por primera vez que el RDV era transmitido por un insecto vector y causa una enfermedad grave del arroz en Asia24,25. El virión es icosaédrico y esférico de doble capa, y la capa externa contiene la proteína22 de la cápside externa P8. El período de transmisión circulativa de RDV en N. cincticeps es de 14 días 26,27,28,29,30. Cuando el RDV llega a las glándulas salivales, los viriones se liberan en las cavidades almacenadas en saliva en las glándulas salivales a través de un mecanismo similar a la exocitosis23. La vitelogenina (Vg) es el precursor proteico vitelino esencial para el desarrollo de ovocitos en insectos hembra31,32,33. La mayoría de las especies de insectos tienen al menos una transcripción Vg de 6-7 kb, que codifica una proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Los precursores proteicos de Vg generalmente se pueden escindir en fragmentos grandes (140 a 190 kDa) y pequeños (<50 kDa) antes de ingresar al ovario18,19. Análisis proteómicos previos revelaron la presencia de los péptidos derivados de Vg en la saliva secretada del saltahojas Recilia dorsalis, aunque se desconoce su función (datos inéditos). Se ha informado recientemente que Vg, que es secretada por vía oral de los saltamontes, funciona como un efector para dañar las defensas de las plantas34. Se desconoce si el Vg de N. cincticeps también podría liberarse al huésped de la planta con flujo salival, y luego podría desempeñar un papel en la planta para interferir con las defensas de la planta. Para abordar si N. cincticeps explota proteínas salivales, como Vg, para inhibir o activar las defensas de la planta, el primer paso es identificar las proteínas liberadas a la planta durante la alimentación. Comprender el método para identificar las proteínas salivales presentes en la planta es potencialmente esencial para explicar la función de las proteínas de la saliva y las interacciones entre los hemípteros y las plantas.
En el protocolo presentado aquí, N. cincticeps se utiliza como ejemplo para proporcionar un método para examinar la presencia de proteínas salivales en la planta huésped introducidas a través de la alimentación de insectos. El protocolo detalla principalmente la recolección y detección de proteínas salivales y es útil para una mayor investigación en la mayoría de los hemípteros.
Protocol
Representative Results
Discussion
La saliva secretada directamente por las glándulas salivales de los insectos perforadores-chupadores juega un papel fundamental porque predigiere y desintoxica los tejidos del huésped y los factores biológicos de los vectores en los huéspedes 1,3,4. Los factores biológicos entre reinos, incluyendo elicitores, efectores y ARN pequeño, son críticos para la comunicación insecto-huésped14,15,16<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31772124 y 31972239) y la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian (subvención KSYLX014).
Materials
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
Referências
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