O kit de ferramentas genômicas funcionais para os nematoides parasitéticos Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti inclui transgênese, mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 e RNAi. Este protocolo demonstrará como usar a microinjeção intragonadal para introduzir componentes transgenes e CRISPR em S. stercoralis e S. ratti.
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Artigo de método
Geração de Transgênicos e Nocautes em Espécies Strongyloides por Microinjeção
Neste artigo
Resumo
Resumo
O gênero Strongyloides consiste em várias espécies de nematoides penetrantes na pele com diferentes faixas hospedeiras, incluindo Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti. S. stercoralis é um nematode parasitário humano-parasitico e penetrante na pele que infecta aproximadamente 610 milhões de pessoas, enquanto o parasita de rato S. ratti está intimamente relacionado com S. stercoralis e é frequentemente usado como modelo de laboratório para S. stercoralis. Tanto S. stercoralis quanto S. ratti são facilmente favoráveis à geração de transgênicos e nocautes através da técnica de entrega de ácido nucleico exógeno da microinjeção intragonadal, e como tal, surgiram como sistemas de modelo para outros helmintos parasitas que ainda não são favoráveis a esta técnica.
Os adultos parasitéticos Strongyloides habitam o intestino delgado de seu hospedeiro e liberam descendentes no ambiente através das fezes. Uma vez no ambiente, as larvas se desenvolvem em adultos livres, que vivem em fezes e produzem descendentes que devem encontrar e invadir um novo hospedeiro. Esta geração ambiental é única para as espécies Strongyloides e semelhante o suficiente em morfologia ao modelo nematode de vida livre Caenorhabditis elegans que técnicas desenvolvidas para C. elegans podem ser adaptadas para uso com esses nematoides parasitas, incluindo microinjeção intragonadal. Usando microinjeção intragonadal, uma grande variedade de transgenes pode ser introduzida em Strongyloides. Os componentes CRISPR/Cas9 também podem ser microinjetados para criar larvas mutantes strongyloides . Aqui, descreve-se a técnica de microinjeção intragonadal em Strongyloides, incluindo a preparação de adultos livres, o procedimento de injeção e a seleção de progêneria transgênica. Imagens de larvas transgênicas strongyloides criadas usando mutagênese CRISPR/Cas9 estão incluídas. O objetivo deste artigo é permitir que outros pesquisadores usem a microinjeção para criar strongyloides transgênicos e mutantes.
Introdução
Strongyloides stercoralis tem sido negligenciado por muito tempo como um importante patógeno humano comparado com as minhocas mais reconhecidas e a lombriga Ascaris lumbricoides1. Estudos anteriores de carga de vermes muitas vezes subestimaram severamente a prevalência de S. stercoralis devido à baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos comuns para S. stercoralis2. Nos últimos anos, estudos epidemiológicos baseados em ferramentas de diagnóstico aprimoradas estimaram que a verdadeira prevalência de infecções por S. stercoralis é muito maior do que o relatado anterio....
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Protocolo
NOTA: Gerbils foram usados para passagem de S. stercoralis, e ratos foram usados para passagem de S. ratti. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Escritório de Supervisão de Pesquisa Animal da UCLA (Protocolo nº 2011-060-21A), que adere às normas AAALAC e ao Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. As seguintes tarefas devem ser concluídas pelo menos um dia antes da microinjeção: cultivo de vermes, preparação de almofadas de microinjeção, criação de construções para a mistura de microinjeção e disseminação de bactérias (E. coli HB101)em placas de 6 cm Nematode Growth Media (NGM). As fêmeas livres requere....
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Resultados
Se o experimento foi bem sucedido, as larvas F1 expressarão o fenótipo de interesse transgênico e/ou mutante (Figura 4). No entanto, as taxas de transformação são altamente variáveis e dependem dos construtos, da saúde dos vermes, das condições de cultivo pós-injeção e da habilidade do experimentador. Em geral, um experimento bem sucedido produzirá > 15 larvas F1 por fêmea injetada e uma taxa de transformação de >3% para marcadores fluorescentes. Se o número total.......
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Discussão
Este protocolo de microinjeção detalha os métodos para a introdução de construções para transgênese e mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 em S. stercoralis e S. ratti. Tanto para S. stercoralis quanto para S. ratti, a sobrevida pós-injeção e a taxa de transgênese ou mutagênese estão sujeitas a várias variáveis que podem ser ajustadas.
A primeira consideração crítica para a transgênese bem sucedida é como transgenes plasmídeos são construídos. Estudos anterio.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
pPV540 e pPV402 foram presentes gentis do Dr. James Lok na Universidade da Pensilvânia. Agradecemos a Astra Bryant por comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por um Burroughs-Wellcome Fund Investigators no Prêmio Patogênese da Doença, um Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award, e National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (&menos;)-Nicotina, ≥ 99% (GC), nicotina líquida | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | para vermes paralisantes |
| Grampo C de ferro de 3", 3" x 2" (capacidade x profundidade) | VWR | 470121-790 | Grampo C para fixar a configuração na bancada |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose para lâminas |
| Carvão de osso, balde de 4 lb, malha 10 x 28 | Carvão Ebonex | n/a | para culturas |
| de carvão fecalCarvão de osso, grânulos, malha 10 x 28 | Reade | bonechar10x28 | carvão para culturas fecais (alternativa ao acima) |
| Micromanipulador grosso | Narishige | MMN-1 | micromanipulador grosso |
| Corning Costar Spin-X filtros de tubo de centrífuga | Fisher | 07-200-385 coluna de | microfiltro |
| Vidro de cobertura, 48 x 60 mm, espessura nº 1 | Brain Research Lab | 4860-1 | lamínulas (48 x 60 mm) |
| Placas de Petri profundas, versão pesada com 6 respiradouros, 100 mm de diâmetro | VWR | 82050-918 Placas de | Petri de 10 cm (para culturas de carvão fecal) |
| Base de retorta Eisco c/ haste | Suporte Fisher | 12-000-101 | para aparelho Baermann |
| Pontas de microcarregador de microinjetor Eppendorf FemtoJet | VWR | 89009-310 | para enchimento de agulhas de microinjeção |
| Underpads absorventes Fisherbrand | Fisher | 14-206-62 | papel de bancada (para preparação) |
| Anéis de ferro fundido Fisherbrand | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand copos de polipropileno tri-encurralado | Fisher | 14-955-111F | Copo de plástico (para mistura) |
| Fisherbrand copos de polipropileno tri-encurralado Fisher | 14-955-111F | Copo de plástico (para balde de captura / balde de água) | |
| Copos de polipropileno tri-cornered Fisherbrand | Fisher | 14-955-111F | Copo de plástico (x2) (para fazer suporte) |
| Gorilla epoxie na seringa | Cola McMaster-Carr | 7541A51 | (para prender o tubo) |
| Óleo halocarbono 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| Tubo de borracha de silicone de alta temperatura para alimentos e bebidas, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | Tubulação 3038K24 | (para funil) |
| Funis KIMAX, haste longa, 60° Ângulo, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Funil Baermann |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science protetores de bancada | Fisher | 15-235-101 | papel de bancada (para preparação) |
| Estereomicroscópio Leica com fluorescência Estereomicroscópio | Leica | M165 FC | GFP para identificação e classificação de vermes transgênicos |
| microINJECTOR porta-agulha de braço reto de latão | Tritech | Sistema | porta-agulha de microinjecção |
| MINJ-4 Sistema de | microinjecção | MINJ-1 | |
| Gerbilos mongóis | Charles River Laboratories | 213-Gerbos de gerbos da Mongólia | para manutenção de S. stercoralis, macho 4-6 semanas |
| Sacos Nasco Whirl-Pak fáceis de fechar, 18 oz | VWR | 11216-776 | Sacos de amostra Whirl-Pak |
| Tule de nylon (malha) | Tecidos Jo-Ann zprd_14061949a | malha de nylon para suporte Baermann | |
| Fio de platina, calibre 36, por polegada | Thomas Scientific | 1233S72 | fio de platina/irídio para palhetas de minhoca |
| Abaixadores de língua puritana, 152 mm (L) x 17,5 mm (L) | VWR | 62505-007 | palitos de madeira (para misturar amostras) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Ratos Long Evans | para manutenção de S. ratti, fêmea 4-6 semanas |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Ratos Sprague Dawley SD | para manutenção de S. ratti, fêmea 4-6 semanas |
| Caixas realmente úteis Caixas de armazenamento translúcidas com tampas, capacidade de 1,6 L, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | caixas plásticas para câmara |
| umidificadaPlaca técnica Shepherd, 8 x 16,5 polegadas | Newco | 999589 | placa técnica |
| Piso de arame elevado em aço inoxidável | Ancare | R20SSRWF | fundos de gaiola de arame |
| Colheres de talheres compostáveis StalkMarket, 6", brancas, pacote de 1.000 | Colheres | de 9587303 | Office Depot |
| Prato de stender, tipo empilhável, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | óculos de relógio (pequenos, redondos) |
| Estereomicroscópio | Motic | K-400 LED | dissecando escopo de preparação |
| Bolsa de armazenamento, cor clara/branca, altura externa 4-7/8 in, comprimento externo 13-5/8 in, Caixas de plástico Sterilite | Grainger | 53GN16 | para câmara umidificada |
| Extrator de micropipeta Sutter P-30 | Extrator | P-30/P | com filamento de platina/irídio |
| Óculos de relógio Syracuse | Fisher | S34826 | óculos de relógio (grandes, redondos) |
| Grampos de ângulo fixo Thermo Scientific Castaloy Grampos de | Fisher | 05-769-2Q | (2x) |
| Micromanipulador hidrólico de óleo de joystick suspenso de três eixos Micromanipulador | fino | Narishige | MM0-4 |
| Grampos de pinchcock United Mohr Grampos de pitada | Fisher | S99422 | Grampos de pitada (2x) |
| Placas de Petri ventiladas de borda afiada (60 mm de diâmetro) | Tritech Placas de | T3308P | de 6 cm (para culturas de carvão fecal em pequena escala) |
| Limpadores de tecido leves VWR | Forro VWR | 82003-820 | para vidro de relógio Baermann holder |
| , quadrado, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | óculos de relógio (pequenos, quadrados) |
| Círculos simples de grau qualitativo Whatman, grau 1, 5,5 cm de diâmetro | Fisher | 09-805B | (para 6 cm de Petri pratos) |
| Círculos lisos de grau qualitativo Whatman, grau 1, papel | Fisher | 09-805D | de diâmetro (para placas de Petri de 10 cm) |
| Capilar de vidro borossilicato World Precision Instrument, 1,2 mm x 4 pol. | Capilares de vidro Fisher | 50-821-813 | para agulhas de microinjeção Facas |
| X-Acto, faca nº 1 com lâmina nº 11 Office | Depot | 238816 | facas X-Acto sem lâminas para segurar picaretas de minhoca |
| Zeiss AxioObserver A1 | Microscópio invertido | Zeiss | n/a |
Referências
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
- Buonfrate, D., et al.
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Reimpressões e permissões
