O presente protocolo descreve uma metodologia aprimorada para o isolamento de ADSC, resultando em um tremendo rendimento celular com ganho de tempo em comparação com a literatura. Este estudo também fornece um método simples para a obtenção de um número relativamente grande de células viáveis após a crioppreservação a longo prazo.
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Artigo de método
Técnica para obtenção de células-tronco mesenquimais a partir da caracterização do tecido adiposo e da fração vascular estromal em criopreservação a longo prazo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco mesenquimais humanas derivadas do tecido adiposo tornaram-se cada vez mais atraentes, pois apresentam características apropriadas e são uma fonte acessível para aplicações clínicas regenerativas. Diferentes protocolos têm sido utilizados para a obtenção de células-tronco derivadas de tecido adiposo. Este artigo descreve diferentes etapas de um protocolo de economia de tempo aprimorado para obter uma quantidade mais significativa de ADSC, mostrando como criopreservar e descongelar o ADSC para obter células viáveis para expansão da cultura. Cem mililitros de lipoaspirado foram coletados, utilizando-se lipoaspiração de seringa de 26 cm de três orifícios e calibre de 3 mm, da região abdominal de nove pacientes que posteriormente foram submetidos à abdominoplastia eletiva. O isolamento das células-tronco foi realizado com uma série de lavagens com solução de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco suplementada com cálcio e o uso de colagenase. As células da Fração Vascular Estromal (SVF) foram criopreservadas, e sua viabilidade foi verificada por imunofenotipagem. O rendimento celular de SVF foi de 15,7 x 105 células/mL, variando entre 6,1-26,2 células/mL. As células SVF aderentes atingiram confluência após uma média de 7,5 (±4,5) dias, com um rendimento celular médio de 12,3 (± 5,7) x 105 células/mL. A viabilidade da FSV descongelada após 8 meses, 1 ano e 2 anos variou entre 23,06%-72,34%, com média de 47,7% (±24,64) com a menor viabilidade correlacionando-se com os casos de congelamento em dois anos. O uso de solução de DPBS suplementada com cálcio e tempos de repouso da bolsa para precipitação de gordura com menor tempo de digestão da colagenase resultou em um aumento do rendimento celular final de células-tronco. O procedimento detalhado para obtenção de altas produtividades de células-tronco viáveis foi mais eficiente em relação ao tempo e rendimento celular do que as técnicas de estudos anteriores. Mesmo após um longo período de criopreservação, células ADSC viáveis foram encontradas na SVF.
Introdução
As células-tronco mesenquimais humanas são vantajosas tanto na pesquisa básica quanto na aplicada. O uso desse tipo de célula adulta supera questões éticas - em comparação com o uso de células embrionárias ou outras - sendo uma das áreas de estudo mais promissoras em engenharia de regeneração de tecidos autólogos e terapia celular1, como a área neoplásica, o tratamento de doenças degenerativas e aplicações terapêuticas na área de cirurgia reconstrutiva 2,3,4, 5. Já foi relatado anteriormente que existe uma fonte abund....
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Protocolo
O presente estudo é aprovado pelo Comitê de Ética da UNIFESP (número de protocolo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), realizado após a obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido dos pacientes de acordo com a Declaração de Helsinque (2004). A amostra do presente estudo é composta por nove pacientes do sexo feminino, com idades entre 33 e 50 anos (média de idade de 41,5) e índice de massa corporal (IMC) inicial médio de 24,54 (variando entre 22,32-26,77) (Tabela 1) que foram submetidas à abdominoplastia estética por excesso de pele após a gestação, na Divisão de Cirurgia Plástica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brasil. P....
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Resultados
A caracterização dos nove indivíduos estudados, incluindo idade, peso, altura e IMC, está apresentada na Tabela 1.
De acordo com o rendimento celular inicialmente apresentado, o volume celular inoculado em cultura foi calculado para ser o mais próximo possível da capacidade do frasco de cultura de 75 cm2. O volume amostral semeado em cada caso está descrito na Tabela 2. Em seguida, de acordo com o rendimento celular inicial, foi determinado um volum.......
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Discussão
Rendimento de isolamento
Está bem estabelecido que o processo de criopreservação, frequentemente necessário na terapia celular, resulta em perda celular significativa, às vezes superior a 50%29,30,35. Assim, um aprimoramento técnico para a obtenção de alto rendimento celular inicial isoladamente é fundamental. O método de coleta de lipoaspirado e o método de isolamento das células devem se concentrar na prese.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos aos pacientes que se ofereceram para participar e à equipe médica e de enfermagem do Hospital São Paulo. Este estudo foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,8 mL criogenials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL saco de transferência de cloreto de polivinila | JP FARMA | 80146150059 | |
| Solução de Vermelho de Alizarina 2%, pH 4,2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenalina (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Solução Alcian Blue | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiótico-Antimicótico 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Citômetro de Fluxo usando BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Cloreto de cálcio 10% | Merck | 102379 | |
| Gluconato de clorexidina 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Colgenase, Tipo I, pó | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS sem cálcio, sem magnésio (Sistemas de Terapia Celular Gibco com Tampão de Fosfato de Dulbecco) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS com cálcio (Sistemas de Terapia Celular Gibco com Tamponamento de Fosfato de Dulbecco) | Gibco | A1285601 | |
| Soro bovino fetal | Gibco | 10500056 | |
| Formaldeído 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| microscópio de luz invertida | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Ensaio de células vivas e mortas | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Anticorpo monoclonal: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Anticorpo monoclonal: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Anticorpo monoclonal: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Anticorpo monoclonal: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Anticorpo monoclonal: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Anticorpo monoclonal: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Anticorpo monoclonal: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Anticorpo monoclonal: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Recipiente de Congelamento Mr. Frosty | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) 1x pH 7.4 | Gibco | ||
| 10010023 Kit de Diferenciação de Adipogênese StemPro | Gibco | A1007001 | |
| Kit de Diferenciação de Condrogênese StemPro | Gibco | A1007101 | |
| Kit de Diferenciação de Osteogênese StemPro | Gibco | A1007201 | |
| Conector estéril com um pico com local de injeção de agulha | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Marca de código: IBS |
| Solução azul de tripano 0,4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Tripsina-EDTA 0,25% 1x, vermelho de fenol | Gibco | 25200056 |
Referências
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a....
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Reimpressões e permissões
