Miniskop in vivo kalsiumavbildning er en kraftig teknikk for å studere nevrondynamikk og mikrokretser i fritt oppførende mus. Denne protokollen beskriver å utføre hjerneoperasjoner for å oppnå god in vivo kalsiumavbildning ved hjelp av et miniskop.
Et miniatyrfluorescensmikroskop (miniskop) er et potent verktøy for in vivo kalsiumavbildning fra fritt oppførende dyr. Det gir flere fordeler i forhold til konvensjonelle multi-photon kalsiumavbildningssystemer: (1) kompakt; (2) nedtonet; (3) rimelig; og (4) tillater opptak fra fritt oppførende dyr. Denne protokollen beskriver hjerneoperasjoner for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning ved hjelp av et spesialutviklet miniskopopptakssystem. Forberedelsesprosedyren består av tre trinn, inkludert (1) stereotaxically injisere viruset i ønsket hjerneregion av en musehjerne for å merke en bestemt undergruppe av nevroner med genetisk kodet kalsiumsensor; (2) implantasjon av gradient-indeks (GRIN) linse som kan videresende kalsium bilde fra dyp hjerne region til miniskopsystemet; og (3) feste miniskopholderen over museskallen der miniskopet kan festes senere. For å utføre in vivo kalsiumavbildning, er miniskopet festet på holderen, og nevronale kalsiumbilder samles sammen med samtidige atferdsopptak. Den nåværende kirurgi protokollen er kompatibel med noen kommersielle eller spesialbygde single-photon og to-photon bildebehandling systemer for dyp hjerne in vivo kalsium avbildning.
Intracellulær Ca2+ signalering er en viktig regulator for cellevekst, spredning, differensiering, migrasjon, gentranskripsjon, sekresjon og apoptose1. I nevroner kontrolleres Ca2+ signalering nøyaktig siden det romlige-temporale mønsteret er relatert til viktige funksjoner som membraneksitabilitet, nevrotransmitterutløsning og synaptisk plastisitet2.
In vivo kalsiumavbildning er en kraftig teknikk som kan brukes til å dekode nevral kretsrepresentasjon elementær til normal dyreatferd, identifisere avvikende nevronaktiviteter i dyremodeller av hjernesykdommer, og avdekke potensielle terapeutiske mål som kan normalisere disse endrede kretsene. De to vanlige in vivo kalsiumavbildningssystemene er tofoton laserskanning fluorescensmikroskopi 3,4,5,6 og hodemontert miniatyrisert mikroskopi (miniskop)7,8,9,10,11,12,13 . Den konvensjonelle to-fotonmikroskopien gir kommanderende fordeler som bedre oppløsning, lavere støy og lavere fotobleaching; De eksperimentelle dyrene må imidlertid være hodefaste, noe som begrenser atferdsstudiene som kan utføres 3,4,5,6. Derimot er det hodemonterte miniskopsystemet lite og bærbart, noe som gjør det mulig å studere et bredt utvalg av atferdstester ved hjelp av fritt oppfører dyr 7,8,9,10,11,12,13.
Det er to ledende Ca2+ indikatorer, kjemiske indikatorer 5,14 og genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer)15,16. Ca2 + avbildning har blitt tilrettelagt ved å bruke svært sensitive GECIer levert med virale vektorer som tillater spesifikk merking av nevroner i den målrettede kretsen. Den kontinuerlige innsatsen for å forbedre følsomheten, levetiden og evnen til å merke selv de subcellulære rommene, gjør GECIer ideelle for ulike in vivo kalsiumavbildningsstudier 17,18,19.
Spredningen av lys i hjernevev under avbildning begrenser den optiske penetrasjonen i dybden, selv med to-fotonmikroskopi. Gradient Index (GRIN)-objektivet overvinner imidlertid dette problemet, da GRIN-objektivet kan bygges direkte inn i det biologiske vevet og videresende bilder fra den dype hjerneregionen til mikroskopmålet. I motsetning til konvensjonell linse laget av optisk homogent materiale og krever en komplisert formet overflate for å fokusere og lage bilder, er GRIN-linseytelsen basert på en gradvis brytningsindeksendring i linsematerialet som oppnår fokus med en planoverflate20. GRIN linse kan fremstilles ned til 0,2 mm i diameter. Derfor kan en miniatyrisert GRIN-linse implanteres i den dype hjernen uten å forårsake for mye skade.
I denne artikkelen presenteres en komplett kirurgiprotokoll for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning. For demonstrasjonsformålet beskriver vi hjerneoperasjoner spesielt rettet mot medial prefrontal cortex (mPFC) av musehjernen og in vivo kalsiumavbildningsopptak via et spesialbygd miniskopsystem utviklet av Dr. Lins gruppe ved National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. Den eksperimentelle prosedyren involverer to store hjerneoperasjoner. Den første operasjonen er stereotaktisk injisere en viral vektor som uttrykker GCaMP6f (en GECI) i mPFC. Den andre operasjonen er å implantere GRIN-linsen i samme hjerneregion. Etter utvinning fra disse hjerneoperasjonene, er den påfølgende prosedyren å feste miniskopholderen (basen) på museskallen ved hjelp av tannsement. In vivo Ca2+ avbildning kan utføres når som helst etter montering av miniskopet på basen. Kirurgiprotokollen for viral injeksjon og GRIN linseimplantasjon er kompatibel med alle kommersielle eller spesialbygde enkeltfoton- og tofotonavbildningssystemer for dyp hjernein vivo kalsiumavbildning.
Et sentralt spørsmål innen nevrovitenskap er å forstå hvordan nevral dynamikk og kretser koder og lagrer informasjon, og hvordan de endres i hjernesykdommer. Ved hjelp av et miniskop in vivo Ca2+ bildebehandlingssystem kan individuell nevral aktivitet fra flere hundre nevroner i en lokal mikrokrets overvåkes samtidig fra et fritt oppførende dyr. Her er en detaljert kirurgiprotokoll for viral injeksjon og GRIN linseimplantasjon beskrevet for å forberede gnagere for en dyp hjerne in vivo Ca2 + avbildning via et spesialutviklet miniskopopptakssystem. Tabell 1 viser sammenligningene av vårt miniskopsystem med andre kommersielt tilgjengelige og spesialbygde miniskopsystemer 7,8,9,10,11,13,25,26. Det er verdt å merke seg at GRIN linse implantasjon ved hjelp av den nåværende kirurgiske protokollen er kompatibel med noen kommersielle eller spesialbygde single-photon og to-photon bildebehandling systemer for en dyp hjerne in vivo kalsium avbildning.
Fra viral injeksjon til datainnsamling av miniskop in vivo kalsiumavbildning tar hele eksperimentell prosedyre minst 2 måneder å fullføre. Det er en komplisert og arbeidsintensiv prosess. Den endelige suksessen til eksperimentet avhenger av flere faktorer, inkludert riktig valg av GECIer, injeksjon av virus nøyaktig i det målrettede hjerneområdet, tilstrekkelig viralt uttrykk i ønsket nevral populasjon, implantasjon av GRIN-linse nettopp på ønsket sted, tilstrekkelig gjenoppretting fra operasjoner, samt om alvorlig betennelse oppstår etter operasjonen, og om dyrets oppførsel er sterkt påvirket av operasjoner, og så videre.
To kritiske trinn inkluderer stereotaxic injeksjon av virus og GRIN linse implantasjon. For demonstrasjonsformålet ble stereotaxisk mikroinjeksjon utført i musen mPFC, med adeno-assosiert virus (AAV1) koding GCaMP6f under kontroll av CaMKII promotor som selektivt merker pyramidale nevroner i mPFC. GCaMP6f ble valgt da det er en av de raskeste og mest følsomme kalsiumindikatorene med en halv forfallstid på 71 ms15. I tillegg er AAV viralt uttrykk for GCaMP6f langvarig (dvs. flere måneder), noe som gjør det ideelt for å utføre repeterende in vivo Ca2 + avbildning over en lang periode for langsgående studier i musemodeller av nevrodegenerative sykdommer27. Den nåværende kirurgiprotokollen kan tilpasses for å målrette mot forskjellige cellepopulasjoner i en hvilken som helst annen hjerneregion. Ulike tilgjengelige virale verktøy tillater selektiv merking av spesifikke nevrale populasjoner i ønsket hjerneregion i ønsket alder. I tillegg kan forskere dra nytte av Cre-LoxP-rekombinasjonssystemet og ulike tilgjengelige transgene musemodeller for å utføre genetiske modifikasjoner og studere det atferdsmessige og nevrale kretsutfallet28,29.
Et unikt trekk ved den presenterte protokollen er at den automatiserte lag-for-lag hjernevevsaspirasjonen ble utført før GRIN-linsen (1 mm i diameter) implantasjon. Dette oppnås gjennom en 27 G nål koblet til et vakuumsystem, styrt av en spesialbygd robotarm og programvare23. Basert på vår erfaring genererer denne metoden en jevn overflate for GRIN-linsen å kontakte og forårsaker mindre skade på nabovevet enn manuell vevsaspirasjon23. Av denne grunn gir denne prosedyren en åpenbar fordel for GRIN-linser med en relativt bredere diameter (f.eks. 1 mm). Vevsaspirasjon er imidlertid kanskje ikke nødvendig for å implantere en GRIN-linse med mindre diameter (0,5 mm eller 0,25 mm). I stedet kan den plantes direkte langs det ledende sporet laget med en 30 G nål21.
I tillegg til de to kritiske trinnene som er diskutert ovenfor, må mange andre faktorer vurderes nøye for en vellykket operasjon. (1) Alle instrumenter som kommer i kontakt med hjernen, bør steriliseres for å forhindre infeksjon. (2) Alle operasjonstrinn må utføres for å minimere skade på hjernen for å forhindre ytterligere betennelse og overdreven arrvevsdannelse. (3) Anestesidosene som gis i utgangspunktet og vedlikeholdes under operasjonen, spesielt de som administreres intraperitonealt, må vurderes nøye. Anestesidosene kan endres i henhold til forskjellige musestammer, da noen kan være mer utsatt. (4) Tilstanden til musen må overvåkes kontinuerlig under operasjonen. Til slutt, (5) musene må regelmessig overvåkes etter operasjonen, da mange komplikasjoner kan oppstå etter operasjonen.
Selv om en del av hjernevev fjernes ensidig under GRIN-linseimplantasjonstrinnet, observerte vi ingen åpenbare atferdsunderskudd 7,12. Vekten på miniskopet er rundt 2 gram og kabelen er spesialdesignet for å gjøre den lett og for å sikre at musen enkelt kan bære den. Miniskopet og kabelen festes kun til dyret før in vivo-avbildning og løsnes etter avbildning. Hele bildebehandlingsprosessen tar vanligvis ikke mer enn 30 minutter. Derfor forhindrer disse instrumenteringene ikke at musen oppfører seg fritt. Miniskopets installasjons- og avinstallasjonstrinn trenger en kort anestesi (mindre enn 2 minutter) med isofluran med det formål å begrense dyr. Vi lar vanligvis musen komme seg etter den korte eksponeringen av isofluran i 30 minutter før du utfører in vivo-avbildning. Vi har utført miniskop in vivo kalsiumavbildning en gang i uken i noen uker uten å merke noen innvirkning på musens helse og mus sosial oppførsel12.
En stor begrensning i det nåværende miniskopopptakssystemet er behovet for å koble mikroskopet til en kabel for datainnsamling. Tilstedeværelsen av kabelen begrenser noen ganger musens oppgaveytelse og begrenser registreringen av ett dyr om gangen. Nylig har et trådløst miniskop blitt utviklet 25,26. Dette vil utvide oppgaveytelsen og tillate samtidig in vivo-avbildning fra flere dyr i en gruppe. Videre vil utvikling av mer sensitive GECIer med spektralt separerbare bølgelengder kombinert med et miniskop med to farger gi mer spennende muligheter for nevrovitenskapelig forskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av tilskudd fra National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 og UG3NS115608.
0.6mm and 1.2mm drill burrs | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
27-G and 30-G needle | BD PrecisionGlide Needle | REF 305109 and REF305106 | For both surgeries |
45 angled forceps | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-151-17 | Surface disinfectant |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-1L | GRIN lens cleaner |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539-25G | For GRIN lens implantation |
Antibiotic ointment | HeliDerm Technology | 81073087 | For virus injection |
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) | Johnson & Johnson Consumer Inc | 30043308 | Acts as pain killer after surgeries |
AutoStereota | NIDA/IRP | github.com/liang-bo/autostereota | For GRIN lens implantation |
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) | Point Grey | Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C | For recording behavior |
Brass hex nut | McMASTER-CARR | 92736A112 | For GRIN lens implantation |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | NDC 4202317905 | For GRIN lens implantation |
Calcium chloride | Sigma | 10043-52-4 | For preparing aCSF |
Commutator | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank | Rocky Mountain Air Solutions | BI-OX-CD5C-K | For GRIN lens implantation |
Compressed Oxygen tank | Rocky Mountain Air Solutions | OX-M-K | For virus injection |
Cordless Microdrill | KF technology | 8000037800 | For craniotomy |
Cyanoacrylate | Henkel Coorporation | # 1811182 | For GRIN lens implantation |
Data acquisition controller | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Data transmission cable | NIDA/IRP | Custom-designed | Component of image acquisition system |
Dental cement set | C&B Metabond and Catalyst | A00253revA306 and A00168revB306 | For GRIN lens implantation |
Dental cement set | Duralay | 2249D | For GRIN lens implantation |
Dexamethasone | VETone | NDC 1398503702 | For GRIN lens implantation |
Dextrose | Sigma | 50-99-7 | For preparing aCSF |
Diet gel | Clear H20 | 72-06-5022 | Diet Supplement for mouse |
GRIN lens | GRINTECH | NEM-100-25-10-860-S | For GRIN lens implantation |
Heating Pad | Physitemp Instruments LLC. | #10023 | To keep the mouse body warm during surgeries |
Isoflurane | VETone | V1 502017 | Anesthesia |
Ketamine | VETone | V1 501072 | For GRIN lens implantation |
Lidocaine | WEST-WARD | NDC 0143-9575-01 | Local anesthesia |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 7791-18-6 | For preparing aCSF |
Microliter syringe (Hamilton) | Hamilton | 7653-01 | For virus injection |
MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instrument | #178647 | For virus injection |
Miniscope | NIDA/IRP | Custom-designed | For imaging |
Miniscope base | Protolabs | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope holding arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For mounting the base |
Miniscope protection cap | Protolabs | Custom-designed | For protecting the miniscope |
Motorized controller | Thorlabs | KMTS50E | For mounting the base |
NeuView | NIDA/IRP | https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 | For in vivo imaging |
Ophthalmic ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Ophthalmic |
PCR tube | Thermo Scientific | AB-0622 | For GRIN lens implantation |
Pinch Clamp | World Precision Instrument | 14040 | For clamping the tubing |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape | TegaSeal PTFE Tape | A-A-58092 | For fastening miniScope to the base |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | For preparing aCSF |
Robotic arm | NIDA/IRP | Custom-designed | For GRIN lens implantation |
Saline | Hospira | RL 7302 | For both surgeries |
Set screw | DECORAH LLC. | 3BT-P9005-00-0025 | For screwing the brass hex nut in miniscope base |
Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD | McMaster | 2124T3 | For irrigation of aCSF |
Sodium bicarbonate | Sigma | 144-55-8 | For preparing aCSF |
Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | For preparing aCSF |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | 7558-80-7 | For preparing aCSF |
Stereotaxic stage | KOPF | Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic | For both surgeries |
Sterile cotton swab | Puritan | REF 806-WC | For both surgeries |
Surgical tools | Fine Science tools | 11251-35 | For surgeries |
Suture | Sofsilk | REF SS683 | For virus injection |
Syringe filter (0.22 µm) | Millex | SLGVR33RS | For filtering aCSF during GRIN lens implantation |
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) | Addgene | 100834-AAV1 | For virus injection |
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml | |||
Xylazine | VETone | V1 510650 | For GRIN lens implantation |