אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים
Summary
אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.
Abstract
כימות התאים נחוץ למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים. ניתוח תמונה קונבנציונלי של תאים משתמש בדרך כלל בגישות לזיהוי פלואורסצנטי, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים או טכניקות לזיהוי קצה, שלעתים קרובות מועדות לשגיאות עקב רעש ואי-אידיאליות אחרות ברקע התמונה.
תכננו אלגוריתם חדש שיכול לספור ולהבחין במדויק מקרופאגים ופיברובלסטים, תאים בעלי פנוטיפים שונים שלעתים קרובות קולוקליים במהלך התחדשות רקמות. MATLAB שימש ליישום האלגוריתם, אשר הבדיל בין סוגי תאים נפרדים בהתבסס על הבדלי גובה מהרקע. אלגוריתם ראשוני פותח בשיטה מבוססת שטח כדי להסביר שינויים בגודל/מבנה התא ובתנאי זריעה בצפיפות גבוהה.
אי-אידיאליות במבני תאים נלקחה בחשבון באמצעות אלגוריתם משני, איטרטיבי, המשתמש בפרמטרים פנימיים כגון כיסוי תאים המחושב באמצעות נתונים ניסיוניים עבור סוג תא נתון. לבסוף, ניתוח של סביבות קוקולטורה בוצע באמצעות אלגוריתם בידוד שבו סוגי תאים שונים לא נכללו באופן סלקטיבי על סמך הערכה של הבדלי גובה יחסיים בתוך התמונה. נמצא כי גישה זו סופרת במדויק תאים בתוך מרווח שגיאה של 5% עבור תאים חד-תרבותיים ובתוך מרווח שגיאה של 10% עבור תאים קוקולטורים.
Introduction
התוכנה מיושמת באופן שגרתי במהלך טכניקות ניתוח תמונה כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, יעילות ובלתי משוחדות. עבור מבחנים מבוססי תאים, בעיה נפוצה היא זיהוי שגוי של תאים. תמונות עם הגדרות מוקד וניגודיות לא נכונות עלולות להוביל לטשטוש תאים, שבו קשה לזהות את הגבול של תאים בודדים1. נוכחות של תכונות תמונה חיצוניות כגון נקבוביות, בועות או עצמים לא רצויים אחרים עלולה לעכב הליכי ספירה על ידי האטת תהליך הספירה ולהוביל לזיהוי שגוי. יתר על כן, ספירת תאים יכולה להיות מכבידה, וספירת מאות שכפולים יכולה לגזול זמן רב. יתר על כן, הטיה סובייקטיבית מובנית קיימת במהלך הספירה הידנית, ולכן קבלת ההחלטות לגבי זיהוי תאים היא לעתים קרובות לא מדויקת2. תוכנה אוטומטית מציעה פוטנציאל מרגש לעקוף את כל הבעיות הללו על ידי הבחנה מהירה ומדויקת של תאים מאובייקטים חיצוניים, כולל עצמים הרבה מעבר ליכולת האנושית לזיהוי מדויק, בהתבסס על קריטריוני זיהוי מוגדרים היטב המפחיתים את ההשפעה של הטיית החוקרים. טכניקות נפוצות לזיהוי תאים באמצעות תוכנה אוטומטית כוללות שתי שיטות עיקריות: פילוח וסף3. בהמשך אנו מדגימים פרוטוקול מבוסס-שטח הניתן להכללה, המאפשר ספירת תאים מהירה, מדויקת וזולה במסגרת תוכנה נגישה באופן נרחב.
טכניקות סגמנטציה, כגון זיהוי קצה, מבקשות לבודד תאים בודדים על ידי שימוש בהבדלי עוצמה בתוך התמונה. שינויי עוצמה המבדילים תא משאר התמונה מורכבים לרוב משינויים חדים בבהירות4. זיהוי קצה כולל שלב סינון רגולרי, ואחריו שלב הבחנה שבו מתגלים שינויי עוצמה. תהליך ההתמיינות מזהה קצוות וקווי מתאר בתוך התמונה של שינויים בעוצמה גבוהה, וקצוות וקווי מתאר אלה מתואמים עם נוכחות התא. למרות שניתן להריץ תמונות עם רעש באמצעות אלגוריתמים המציינים4, טכניקות זיהוי קצה משמשות באופן אידיאלי לניתוח תמונות עם רעשי רקע נמוכים. התהליך מתפקד בצורה אופטימלית כאשר גבולות התא ניתנים להבחנה ברורה וקלה ואינם מונעים על ידי קווי מתאר של בהירות שאינם קשורים לנוכחות תאים, טשטוש תאים, עצמים חיצוניים או מבני תאים פנימיים מוגדרים 1,2. אם תמונה רועשת במיוחד, ניתן להבחין עוד יותר בתאים באמצעות צביעה פלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים 2,5. למרות שזה משפר באופן משמעותי את הדיוק של טכניקות סגמנטציה, זה דורש עלויות נוספות והשקעות זמן נוספות כדי להכין תרביות תאים להדמיה.
טכניקות סף כוללות חלוקה של תמונה לשתי קטגוריות: החזית והרקע, כאשר התאים מוקצים לחזית3. טכניקות אלה משתמשות בשינויי צבע/ניגודיות כדי להגדיר את הגובה הנראה לעין של אובייקט; אובייקטים שהם באופן שגרתי ‘גבוהים’ יותר מהרקע ניתנים לזיהוי בקלות כתאים. שינוי קו פרשת המים פועל בדרך זו על ידי שיוך משטחים עם פיקסלים בהירים כחזית ואלה עם פיקסלים כהים כרקע 6,7. באמצעות זיהוי מבוסס גובה, טכניקות סף יכולות להבחין באופן שגרתי בין רעש לאובייקטים רצויים, בתנאי שהם קיימים באותו מישור מוקד. בשילוב עם כימות מבוסס שטח, שינוי קו פרשת מים יכול לזהות במדויק קבוצות של עצמים בסביבות שבהן טכניקות סגמנטציה טיפוסיות כגון זיהוי קצה יהיו לא מדויקות.
טרנספורמציות של קו פרשת המים משולבות בדרך כלל עם טכניקות סגמנטציה כדי להכין תמונות לניתוח נקי יותר, והתוצאה היא דיוק גבוה יותר של ספירת תאים. עבור תהליך זה, שינוי קו פרשת המים משמש להדגשת אזורי עניין פוטנציאליים לפני הפילוח. התמרת קו פרשת המים מספקת יתרונות ייחודיים על-ידי זיהוי תאים בחזית התמונות, מה שיכול לשפר את הדיוק של ניתוח סגמנטציה על-ידי הסרת תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות עבור תאים, כגון כתמי רקע לא אחידים. עם זאת, קשיים יכולים להתעורר כאשר מנסים להתאים תמונות מבוססות תאים לשינוי קו פרשת המים. תמונות עם צפיפות תאים גבוהה עלולות להיות נגועות בתת-סגידה, שבה אגרגטים של תאים מזוהים כקבוצה סינגולרית ולא כמרכיבים בודדים. נוכחות של רעש או שינויי עוצמה חדים יכולה גם לגרום לטענת יתר, שבה האלגוריתם מרחיב את התאים יתר על המידה, וכתוצאה מכך ספירת תאים מוגזמת ולא מדויקת8.
בהמשך, אנו מפרטים שיטה למזער את החסרונות העיקריים של התמרת קו פרשת המים על ידי שילוב רכיבים של ניתוח סף בתוך אלגוריתם כימות מבוסס שטח, כפי שמתואר באיור 1. יש לציין כי אלגוריתם זה יושם עם תוכנות קוד פתוח ו/או זמינות באופן נרחב, ויישום של מסגרת ספירת תאים זו התאפשר ללא ריאגנטים יקרים או טכניקות מורכבות להכנת תאים. מקרופאגים RAW264.7 שימשו להדגמת השיטה בשל תפקידם הקריטי בוויסות תחזוקת רקמות חיבור ותהליכי ריפוי פצעים9. בנוסף, פיברובלסטים NIH/3T3 נותחו בשל תפקידם המרכזי בתחזוקה ותיקון של רקמות. תאים פיברובלסטים מתקיימים לעתים קרובות יחד עם מקרופאגים ותומכים בהם, מה שיוצר את הצורך להבחין בין סוגי תאים מובחנים פנוטיפיים אלה במחקרי קוקולטורה.
ניתן לכמת את ספירת התאים מתמונות בעלות צפיפות תאים בת קיימא גבוהה (VCD) באופן אמין ויעיל על-ידי חישוב השטח המכוסה על-ידי התאים, והאזור הממוצע שתופס תא יחיד. השימוש בסף לעומת סגמנטציה לזיהוי תאים איפשר גם ניתוחים מורכבים יותר, כגון ניסויים שבהם נותחו סוגי תאים שונים בקוקולטורות במקביל. פיברובלסטים NIH/3T3, שלעתים קרובות נמצא כי הם מתמזגים עם מקרופאגים RAW264.7 בתוך אתר ריפוי פצעים, נמצאו כמיגדלים במישור מוקד שהיה נבדל ממישור המוקד של המקרופאגים10. בהתאם לכך, הופעלו מספר אלגוריתמי סף כדי להגדיר את הרקע והחזית בהתאם לסוג התא המנותח, מה שמאפשר ספירה מדויקת של שני סוגי תאים שונים בתוך אותה תמונה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תכננו הליך כללי מבוסס שטח שספר תאים באופן מדויק ויעיל על בסיס גובה התא, ומאפשר כמות ללא כתמים של תאים אפילו במערכות קוקולטורה. שלבים קריטיים להליך זה כללו יישום של מערכת עוצמה יחסית שבאמצעותה ניתן היה להתמיין בין תאים. השימוש בניתוח גובה יחסי שירת שתי מטרות: הצורך בפרמטרים חיצוניים הפך למי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AR067247) ובחלקה על ידי תוכנית INBRE של דלאוור, הנתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים – NIGMS (P20 GM103446) מהמכונים הלאומיים לבריאות ומדינת דלאוור. תוכן כתב היד אינו משקף בהכרח את דעותיהם של הגורמים המממנים.
Materials
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL – 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB – 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
Referências
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. – 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T. On edge detection. MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022)
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022)
- Atherton, T., Kerbyson, D. Size invariant circle detection. Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
