Monitoring van borstkankergroei en gemetastaseerde kolonievorming bij muizen met behulp van bioluminescentie
Summary
Hier beschrijven we een niet-invasieve monitoringmethode met luciferase en groene fluorescerende eiwitexpressie in verschillende borstkankercellijnen. Dit protocol biedt een techniek om tumorvorming en gemetastaseerde kolonisatie in realtime bij muizen te volgen.
Abstract
Borstkanker is een frequente heterogene maligniteit en de tweede belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen, voornamelijk als gevolg van orgaanmetastase op afstand. Er zijn verschillende diermodellen gegenereerd, waaronder de veelgebruikte orthotopische muismodellen, waarbij kankercellen in het borstvetkussen worden geïnjecteerd. Deze modellen kunnen echter niet helpen bij het monitoren van tumorgroeikinetiek en gemetastaseerde kolonisatie. Geavanceerde hulpmiddelen om kankercellen in realtime bij muizen te volgen, zullen het begrip van tumorbiologie aanzienlijk verbeteren.
Hier werden borstkankercellijnen vastgesteld die stabiel luciferase en groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen. Specifiek bevat deze techniek twee opeenvolgende stappen geïnitieerd door het meten van de luciferase-activiteit in vitro en gevolgd door de implantatie van de kankercellen in borstvetkussens van niet-obese diabetische-ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD-SCID) muizen. Na de injectie worden zowel de tumorgroei als de gemetastaseerde kolonisatie in realtime gevolgd door het niet-invasieve bioluminescentiebeeldvormingssysteem. Vervolgens zal de kwantificering van GFP-expresserende metastasen in de longen worden onderzocht door fluorescentiemicroscopie om de waargenomen bioluminescentieresultaten te valideren. Dit geavanceerde systeem dat luciferase en fluorescentie-gebaseerde detectietools combineert, evalueert kankermetastase in vivo, wat een groot potentieel heeft voor gebruik in borstkankertherapieën en ziektebeheer.
Introduction
Borstkankers zijn wereldwijd frequente vormen van kanker, met ongeveer 250.000 nieuwe gevallen die elk jaar in de Verenigde Staten worden gediagnosticeerd1. Ondanks de hoge incidentie heeft een nieuwe reeks geneesmiddelen tegen kanker de resultaten van borstkankerpatiënten aanzienlijk verbeterd2. Deze behandelingen zijn echter nog steeds ontoereikend, omdat veel patiënten een terugval van de ziekte en gemetastaseerde verspreiding naar vitale organenervaren 2, wat de primaire oorzaak is van morbiditeit en mortaliteit van de patiënt. Daarom is een van de belangrijkste uitdagingen in borstkankeronderzoek het identificeren van de moleculaire mechanismen die de vorming van distale metastasen reguleren om nieuwe middelen te ontwikkelen om hun ontwikkeling te remmen.
Kankermetastase is een dynamisch proces waarbij cellen zich losmaken van de primaire tumor en via de bloedcirculatie naburige weefsels binnendringen. Diermodellen waarin de cellen een vergelijkbare gemetastaseerde cascade ondergaan, kunnen dus de identificatie van de mechanismen die dit proces beheersenvergemakkelijken 3,4. Bovendien zijn deze in vivo modellen essentieel voor de ontwikkeling van borstkanker therapeutische middelen 5,6. Deze orthotopische modellen kunnen echter niet de werkelijke tumorgroeikinetiek aangeven, omdat het effect pas bij beëindiging wordt bepaald. Daarom hebben we een op luciferase gebaseerd hulpmiddel opgezet om tumorontwikkeling en gemetastaseerde kolonisatie in realtime te detecteren. Bovendien drukken deze cellen GFP uit om de gemetastaseerde kolonies te detecteren. Deze aanpak is relatief eenvoudig en omvat geen invasieve procedures3. Het combineren van luciferase en fluorescentiedetectie is dus een nuttige strategie om de preklinische studies van borstkankertherapieën en ziektebeheer te bevorderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dierproeven zijn verplicht voor kankeronderzoek 7,8,9, en inderdaad zijn er veel protocollen ontwikkeld 3,6,10,11,12,13,14. De meeste van deze studies bepaalden het biologische effect echter pas aan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van het Y.D.S. laboratorium. We willen het Wohl Institute for Translational Medicine in het Hadassah Medical Center, Jeruzalem, bedanken voor het bieden van de beeldvormingsfaciliteit voor kleine dieren. Deze studie werd ondersteund door de Research Career Development Award van het Israel Cancer Research Fund.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
Referências
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
