Biyolüminesans Kullanarak Farelerde Meme Kanseri Büyümesi ve Metastatik Koloni Oluşumunun İzlenmesi
Summary
Burada, çeşitli meme kanseri hücre hatlarında lusiferaz ve yeşil floresan protein ekspresyonunu içeren noninvaziv bir izleme yöntemini tanımladık. Bu protokol, farelerde tümör oluşumunu ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir teknik sağlar.
Abstract
Meme kanseri sık görülen heterojen bir malignitedir ve kadınlarda özellikle uzak organ metastazı nedeniyle mortalitenin ikinci önde gelen nedenidir. Kanser hücrelerinin meme yağ yastığına enjekte edildiği yaygın olarak kullanılan ortopik fare modelleri de dahil olmak üzere çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, bu modeller tümör büyüme kinetiğini ve metastatik kolonizasyonu izlemeye yardımcı olamaz. Farelerde kanser hücrelerini gerçek zamanlı olarak izlemek için en yeni araçlar, tümör biyolojisinin anlaşılmasını önemli ölçüde ilerletecektir.
Burada, lusiferaz ve yeşil floresan proteini (GFP) kararlı bir şekilde eksprese eden meme kanseri hücre hatları oluşturulmuştur. Spesifik olarak, bu teknik, in vitro lusiferaz aktivitesinin ölçülmesiyle başlatılan ve ardından kanser hücrelerinin obez olmayan diyabetik-şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD-SCID) farelerinin meme yağ pedlerine implantasyonu ile başlatılan iki ardışık adım içerir. Enjeksiyondan sonra, hem tümör büyümesi hem de metastatik kolonizasyon, noninvaziv biyolüminesans görüntüleme sistemi tarafından gerçek zamanlı olarak izlenir. Daha sonra, akciğerlerdeki GFP eksprese eden metastazların miktarı, gözlemlenen biyolüminesans sonuçlarını doğrulamak için floresan mikroskobu ile incelenecektir. Lusiferaz ve floresan bazlı tespit araçlarını birleştiren bu sofistike sistem, meme kanseri terapötiklerinde ve hastalık yönetiminde kullanım için büyük potansiyele sahip olan kanser metastazını in vivo olarak değerlendirir.
Introduction
Meme kanserleri dünya çapında sık görülen kanser türleridir ve Amerika Birleşik Devletleri’nde her yıl yaklaşık 250.000 yeni vaka teşhis edilmektedir1. Yüksek insidansına rağmen, yeni bir antikanser ilaç seti meme kanseri hasta sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirmiştir2. Bununla birlikte, birçok hasta hastalık nüksetmesi ve hasta morbidite ve mortalitesinin birincil nedeni olan hayati organlara metastatik yayılım2 yaşadığından bu tedaviler hala yetersizdir. Bu nedenle, meme kanseri araştırmalarındaki temel zorluklardan biri, gelişimlerini engellemek için yeni araçlar geliştirmek üzere distal metastazların oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamaktır.
Kanser metastazı, hücrelerin birincil tümörden ayrıldığı ve kan dolaşımı yoluyla komşu dokuları istila ettiği dinamik bir süreçtir. Böylece, hücrelerin benzer bir metastatik kaskaddan geçtiği hayvan modelleri, bu süreci yöneten mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırabilir 3,4. Ek olarak, bu in vivo modeller meme kanseri terapötik ajanlarının geliştirilmesi için gereklidir 5,6. Bununla birlikte, bu ortotopik modeller gerçek tümör büyüme kinetiğini gösteremez, çünkü etki sadece sonlandırma üzerine belirlenir. Bu nedenle, tümör gelişimini ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak tespit etmek için lusiferaz bazlı bir araç kurduk. Ek olarak, bu hücreler metastatik kolonileri tespit etmek için GFP’yi eksprese eder. Bu yaklaşım nispeten basittir ve herhangi bir invaziv prosedür içermez3. Bu nedenle, lusiferaz ve floresan tespitini birleştirmek, meme kanseri terapötikleri ve hastalık yönetimi ile ilgili klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için yararlı bir stratejidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayvan temelli deneyler kanser araştırmaları için zorunludur 7,8,9 ve gerçekten de birçok protokol geliştirilmiştir 3,6,10,11,12,13,14. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu biyolojik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.D.S. laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Kudüs’teki Hadassah Tıp Merkezi’ndeki Wohl Translasyonel Tıp Enstitüsü’ne küçük hayvan görüntüleme tesisini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, İsrail Kanser Araştırma Fonu’ndan Araştırma Kariyer Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
Referências
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
