Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC’s ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.
Lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC’s) zijn gespecialiseerde endotheelcellen op het grensvlak tussen de circulatie en het leverparenchym. LSEC’s hebben een duidelijke morfologie die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van fenestrae en de afwezigheid van keldermembraan. LSEC’s spelen een essentiële rol bij veel pathologische aandoeningen in de lever, waaronder metabole ontregeling, ontsteking, fibrose, angiogenese en carcinogenese. Er is echter weinig gepubliceerd over de isolatie en karakterisering van de LSEC’s. Hier bespreekt dit protocol de isolatie van LSEC van zowel gezonde als niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) muizen. Het protocol is gebaseerd op collagenaseperfusie van de lever van de muis en magnetische kralen positieve selectie van niet-parenchymale cellen om LSEC’s te zuiveren. Deze studie karakteriseert LSEC’s met behulp van specifieke markers door flowcytometrie en identificeert de karakteristieke fenotypische kenmerken door scanning elektronenmicroscopie. LSEC’s die volgens dit protocol zijn geïsoleerd, kunnen worden gebruikt voor functionele studies, waaronder adhesie- en permeabiliteitstests, evenals downstreamstudies voor een bepaald interessetraject. Bovendien kunnen deze LSEC’s worden samengevoegd of afzonderlijk worden gebruikt, waardoor multi-omics gegevens kunnen worden gegenereerd, waaronder RNA-seq bulk of eencellig, proteomisch of fosfo-proteomics en assay voor Transposase-Toegankelijk Chromatine met behulp van sequencing (ATAC-seq), onder anderen. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die de communicatie van LSEC’s met andere levercellen in gezondheid en ziekte bestuderen en een diepgaand begrip mogelijk maken van de rol van LSEC’s in de pathogene mechanismen van acute en chronische leverbeschadiging.
Lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC’s) langs de hepatische sinusoïde wanden en zijn de meest voorkomende niet-parenchymale cellen in de lever1. LSEC’s onderscheiden zich van andere capillaire endotheelcellen elders in het lichaam door de aanwezigheid van fenestrae en het ontbreken van een klassiek keldermembraan of een diafragma 2,3. Vandaar dat de LSEC’s onderscheidende fenotypische en structurele kenmerken bezitten die hun permeabiliteit en endocytische capaciteit verbeteren om een verscheidenheid aan circulerende macromoleculen, waaronder lipiden en lipoproteïnen, te elimineren. LSEC’s spelen een cruciale rol in de kruisverwijzing tussen parenchymale en niet-parenchymale cellen, zoals stellaatcellen en immuuncellen. LSEC’s zijn de sleutel tot het handhaven van leverhomeostase door de stellaatcellen en Kupffer-cellen in een rustige statuste houden 4. LSEC’s moduleren de samenstelling van hepatische immuuncellenpopulaties door adhesie en trans-endotheelmigratie van circulerende leukocyten te bemiddelen 5,6. Tijdens acute en chronische leverbeschadiging7, waaronder ischemie-reperfusieletsel (IRI)8, niet-alcoholische steatohepatitis (NASH)9 en hepatocellulair carcinoom (HCC), ondergaan LSEC’s fenotypische veranderingen die bekend staan als capillarisatie gekenmerkt door defenestratie en vorming van keldermembraan10. Deze fenotypische veranderingen in LSEC’s zijn geassocieerd met LSEC-disfunctie en de verwerving van protrombotische, pro-inflammatoire en profibrogene eigenschappen.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld voor de isolatie van LSEC’s van muizenlever11. Sommige technieken zijn afhankelijk van het scheiden van niet-parenchymale en parenchymale cellen gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie om de LSEC’s te zuiveren van niet-parenchymale fracties. De beperking van deze methode is de aanwezigheid van contaminerende macrofagen in de laatste stappen van LSEC-isolatie, wat de zuiverheid van de geïsoleerde LSEC’s zou kunnen beïnvloeden12. Dit protocol is gebaseerd op collagenaseperfusie van de muizenlever en CD146 + magnetische kralen positieve selectie van niet-parenchymale cellen om LSEC’s te zuiveren. LSEC’s die met deze methode zijn geïsoleerd, vertonen een hoge zuiverheid en behouden morfologie en levensvatbaarheid. Deze LSEC’s zijn optimaal voor functionele studies, waaronder permeabiliteit en adhesietest, evenals downstream studies voor routes van belang. Bovendien, met de groeiende interesse in het genereren van grote datasets in zowel klinisch onderzoek als ontdekkingswetenschap, kunnen deze hoogwaardige LSEC’s geïsoleerd uit zowel gezonde als zieke levers met niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) of andere aandoeningen worden samengevoegd of afzonderlijk worden gebruikt, waardoor multi-omics gegevens kunnen worden gegenereerd en vergelijking tussen gezondheid en ziekte13,14 . Bovendien kunnen de geïsoleerde LSEC’s worden gebruikt om zowel tweedimensionale als driedimensionale in vitro modellen zoals organoïden te ontwikkelen om de geactiveerde signaalroute in LSEC’s en hun intercellulaire communicatie met andere levercellen te ontcijferen onder verschillende schadelijke stimuli en als reactie op verschillende therapeutische interventies.
In het huidige manuscript beschrijven we een protocol voor LSEC-isolatie van muizenlever bestaande uit tweestaps collagenaseperfusie en daaropvolgende magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). Dit protocol bestaat uit de volgende drie stappen: (1) Perfusie door de PV met een calciumvrije buffer gevolgd door een collagenase-bevattende buffer om leverceldispersie te bereiken; (2) Uitsluiting van hepatocyten met centrifugeren met lage snelheid; en (3) MACS-gebaseerde positieve selectie van LSEC’s uit niet-parenchymale ce…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases van de NIH (1RO1DK122948 tot SHI) en het NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30-subsidiemechanisme (DK084567). Ondersteuning werd ook aan KF verleend door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. We willen ook Dr. Gregory J. Gores en Steven Bronk bedanken voor hun oorspronkelijke ontwerp en optimalisatie van het collagenase-perfusieapparaat.
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |