Métodos de cultivo directo e indirecto para el estudio de materiales de implantes biodegradables in vitro
Summary
Introducimos tres métodos de cultivo directo, cultivo de exposición directa y cultivo de exposición para evaluar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables. Estos métodos in vitro imitan diferentes interacciones célula-implante in vivo y se pueden aplicar para estudiar diversos materiales biodegradables.
Abstract
En las últimas décadas, los materiales biodegradables se han explorado ampliamente para aplicaciones biomédicas como implantes ortopédicos, dentales y craneomaxilofaciales. Para detectar materiales biodegradables para aplicaciones biomédicas, es necesario evaluar estos materiales en términos de respuestas celulares in vitro , citocompatibilidad y citotoxicidad. Las normas de la Organización Internacional de Normalización (ISO) se han utilizado ampliamente en la evaluación de biomateriales. Sin embargo, la mayoría de las normas ISO se establecieron originalmente para evaluar la citotoxicidad de los materiales no degradables, proporcionando así un valor limitado para el cribado de materiales biodegradables.
Este artículo presenta y discute tres métodos de cultivo diferentes, a saber, el método de cultivo directo, el método de cultivo de exposición directa y el método de cultivo de exposición para evaluar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables, incluidos polímeros biodegradables, cerámicas, metales y sus compuestos, con diferentes tipos de células. La investigación ha demostrado que los métodos de cultivo influyen en las respuestas celulares a los materiales biodegradables porque su degradación dinámica induce diferencias espaciotemporales en la interfaz y en el entorno local. Específicamente, el método de cultivo directo revela las respuestas de las células sembradas directamente sobre los implantes; el método de cultivo de exposición directa aclara las respuestas de las células huésped establecidas que entran en contacto con los implantes; y el método de cultivo de exposición evalúa las células huésped establecidas que no están en contacto directo con los implantes, pero están influenciadas por los cambios en el entorno local debido a la degradación del implante.
Este artículo proporciona ejemplos de estos tres métodos de cultivo para estudiar la citocompatibilidad in vitro de materiales de implantes biodegradables y sus interacciones con células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (BMSC). También describe cómo cosechar, pasar, cultivar, sembrar, fijar, teñir, caracterizar las células y analizar los medios y materiales posteriores al cultivo. Los métodos in vitro descritos en este artículo imitan diferentes escenarios del entorno in vivo , ampliando la aplicabilidad y relevancia de las pruebas de citocompatibilidad in vitro de diferentes biomateriales para diversas aplicaciones biomédicas.
Introduction
Durante décadas, los materiales biodegradables han sido ampliamente estudiados y utilizados en aplicaciones biomédicas como aplicaciones ortopédicas1,2, dentales3,4 y craneomaxilofaciales5. A diferencia de los implantes y materiales permanentes, los metales biodegradables, la cerámica, los polímeros y sus compuestos se degradan gradualmente en el cuerpo con el tiempo a través de diferentes reacciones químicas en el entorno fisiológico. Por ejemplo, los metales biodegradables como las aleaciones de magnesio (Mg)1,6,7 y las aleaciones de zinc (Zn)8,9 son materiales prometedores para dispositivos de fijación ósea. Su biodegradabilidad podría eliminar la necesidad de cirugías secundarias para retirar los implantes después de la curación ósea. Las cerámicas biodegradables como los cementos de fosfato de calcio (CPC) han mostrado un potencial emocionante para el tratamiento de fracturas por compresión vertebral osteoporótica en la cifoplastia percutánea10. Los CPC proporcionan soporte mecánico para el cuerpo vertebral fracturado y se degradan gradualmente después de que la fractura se ha curado.
Los polímeros biodegradables, como algunos polisacáridos y poliésteres, también se han explorado ampliamente para aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, el hidrogel de quitosano como polisacárido biodegradable ha demostrado sus capacidades para prevenir infecciones y regenerar el tejido de la piel11. El ácido poli-L-láctico (PLLA), el poli(ácido glicólico) (PGA) y el poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) son poliésteres ampliamente estudiados para la fabricación de andamios porosos 2D o 3D para aplicaciones de ingeniería de tejidos12,13,14. Además, los materiales compuestos integran dos o más fases de metales, cerámicas y polímeros para proporcionar funciones avanzadas para una amplia gama de aplicaciones biomédicas15,16,17. Por ejemplo, los compuestos de PLGA y fosfato de calcio se pueden utilizar para fabricar andamios biodegradables para aplicaciones como la reparación de defectos óseos del cráneo18. Estos andamios e implantes biodegradables podrían apoyar y promover el crecimiento de células y tejidos y luego degradarse gradualmente en el cuerpo con el tiempo.
Como se muestra en la Tabla Suplementaria 1, los diferentes materiales biodegradables pueden tener diversos mecanismos, productos y tasas de degradación. Por ejemplo, las aleaciones de magnesio, como Mg-2 % en peso de Zn-0,5 % en peso de Ca (ZC21)1, Mg-4 en peso de Zn-1 % en peso de Sr (ZSr41)19 y Mg-9 en peso de Al-1 % en peso de zinc (AZ91)20, se degradan al reaccionar con el agua, y sus productos de degradación incluyen principalmente iones Mg2+, iones OH, gas H2 y deposiciones minerales. La tasa de degradación de los metales biodegradables varía en función de sus diferentes composiciones, geometrías y entornos de degradación. Por ejemplo, Cipriano et al.19 informaron que los cables ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) perdieron un 85% de masa, mientras que los cables mg puros con la misma geometría perdieron un 40% de masa después de ser implantados en las tibias de rata durante 47 días. Los materiales cerámicos biodegradables como la hidroxiapatita (HA) y el fosfato β-tricálcico (β-TCP) pueden degradarse a través de la disolución líquida extracelular impulsada por la solución o descomponerse en pequeñas partículas y luego degradarse a través de la disolución líquida extracelular y los procesos de reabsorción mediados por células. Los productos de degradación de estas cerámicas a base de fosfato de calcio pueden incluir iones Ca2+, iones (PO4)3-, iones OH– y deposiciones minerales21. La tasa de degradación de las cerámicas de fosfato de calcio se ve afectada significativamente por sus estructuras cristalinas. Por ejemplo, Van Blitterswijk et al.22 informaron que la HA con 40 vol.% de microporos no perdió masa, mientras que β-TCP con 40 vol.% de microporos perdió 30 ± 4% de masa después de ser implantado en las tibias de conejos durante 3 meses. Los polímeros como PLGA14,23 pueden degradarse debido a la hidrólisis de los enlaces éster en presencia de agua, y los productos de degradación incluyen principalmente ácidos láctico y glicólico. El EGLP 50/50 puede tardar un mes y varios meses en lograr la degradación completa24.
La respuesta celular y las pruebas de citocompatibilidad son fundamentales para evaluar y examinar estos materiales de implantes biodegradables para aplicaciones biomédicas. Sin embargo, las normas actuales de la Organización Internacional de Normalización (ISO), como ISO 10993-5:2009 “Evaluación biológica de dispositivos médicos-Parte 5 Pruebas para la citotoxicidad in vitro“, se diseñaron inicialmente para evaluar la citotoxicidad de biomateriales no degradables como aleaciones Ti y aleaciones Cr-Co de vitro25. Específicamente, ISO 10993-5: 2009 solo cubre las pruebas de citotoxicidad in vitro del extracto, las pruebas de contacto directo y las pruebas de contacto indirecto. En la prueba de extracto, el extracto se prepara sumergiendo muestras en fluidos de extracción como medios de cultivo con soluciones salinas séricas y fisiológicas bajo una de las condiciones estándar de tiempo y temperatura. El extracto o dilución recolectado se agrega al cultivo celular para estudiar la citotoxicidad. Para la prueba de contacto directo, el contacto directo entre la muestra y las células se logra colocando la muestra de prueba en la capa celular establecida (adherida). En la prueba de contacto indirecto, el medio de cultivo que contiene suero y agar derretido se pipetea para cubrir las células establecidas. La muestra se coloca sobre la capa de agar solidificado con o sin filtro.
Las normas ISO han mostrado algunas limitaciones cuando se aplican para evaluar materiales biodegradables in vitro. A diferencia de los materiales no degradables, los comportamientos de degradación de los materiales biodegradables son dinámicos y pueden cambiar en un momento diferente o en condiciones ambientales variadas (por ejemplo, temperatura, humedad, composición de medios y tipo de célula). La prueba de extracto solo evalúa la citotoxicidad de los productos de degradación del material y no refleja el proceso dinámico de degradación de la muestra. Tanto las pruebas de contacto directo como las indirectas de la norma ISO solo caracterizan las interacciones entre las células y muestras establecidas. Además, en la prueba de contacto indirecto, los materiales y las células se encuentran en diferentes microambientes que no reflejan el entorno in vivo y no capturan la degradación dinámica de los materiales biodegradables.
El objetivo de este artículo es introducir y discutir los métodos de prueba de citocompatibilidad para diversos materiales de implantes biodegradables para abordar las limitaciones mencionadas anteriormente de los métodos descritos en las normas ISO actuales. Los métodos presentados en este artículo consideran el comportamiento dinámico de degradación de los materiales de implante y las diferentes circunstancias de las interacciones célula-material in vivo. Específicamente, este artículo proporciona tres métodos de prueba de citocompatibilidad, a saber, cultivo directo, cultivo de exposición directa y cultivo de exposición para diversos materiales biodegradables, incluidos polímeros biodegradables, cerámicas, metales y sus compuestos para aplicaciones de implantes médicos.
En el método de cultivo directo, las células suspendidas en los medios de cultivo se siembran directamente en las muestras, evaluando así las interacciones entre las células recién sembradas y los implantes. En el cultivo de exposición directa, las muestras se colocan directamente sobre la capa celular establecida para imitar las interacciones de los implantes con las células huésped establecidas en el cuerpo. En el cultivo de exposición, las muestras se colocan en sus respectivos insertos de pozo y luego se introducen en los pozos de cultivo con células establecidas, lo que caracteriza las respuestas de las células establecidas a los cambios en el entorno local inducidos por la degradación del implante cuando no tienen contacto directo con los implantes. Los métodos de cultivo directo y cultivo de exposición directa evalúan las células directa o indirectamente en contacto con los materiales del implante en el mismo pozo de cultivo. El cultivo de exposición caracteriza las células indirectamente en contacto con los materiales del implante dentro de una distancia prescrita en el mismo pozo de cultivo.
Este artículo presenta una descripción detallada de las pruebas de citocompatibilidad para diferentes materiales biodegradables y sus interacciones con células modelo, es decir, células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (BMSC). Los protocolos incluyen la cosecha, el cultivo, la siembra, la fijación, la tinción y la obtención de imágenes de las células, junto con análisis de materiales y medios de postcultivo, que se aplican a una variedad de materiales de implantes biodegradables y una amplia gama de tipos de células. Estos métodos son útiles para el cribado de materiales biodegradables para diferentes aplicaciones biomédicas en términos de respuestas celulares y citocompatibilidad in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se pueden utilizar diferentes métodos de cultivo celular para evaluar la citocompatibilidad in vitro de biomateriales de interés para diversos aspectos de aplicaciones in vivo. Este artículo demuestra tres métodos de cultivo in vitro , es decir, cultivo directo, cultivo de exposición directa y cultivo de exposición, para imitar diferentes escenarios in vivo donde se utilizan materiales de implantes biodegradables dentro del cuerpo humano. El método de cultivo directo se utiliza …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores aprecian el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (premio NSF CBET 1512764 y NSF PIRE 1545852), los Institutos Nacionales de Salud (NIH NIDCR 1R03DE028631), la Beca de Desarrollo Docente de Regentes de la Universidad de California (UC) y la Beca de Investigación de Semillas del Comité de Investigación (Huinan Liu) y la Beca de Investigación de Disertación UC-Riverside (Jiajia Lin). Los autores aprecian la Instalación Central de Microscopía y Microanálisis Avanzados (CFAMM) en la UC-Riverside por el uso de SEM / EDS y el Dr. Perry Cheung por el uso de instrumentos XRD. Los autores también aprecian a Thanh Vy Nguyen y Queenie Xu por su edición parcial. Los autores también desean agradecer a Cindy Lee por grabar la narración del video. Cualquier opinión, hallazgo y conclusión, o recomendación expresada en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la Fundación Nacional de Ciencias o los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 10 mL serological pipette | VWR | 490019-704 | |
| 12-well tissue-culture-treated plates | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G needle | BD | 305196 | |
| 25½ G needle | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2- phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL conical tube (Polypropylene) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μm nylon strainer | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| Biological safety cabinet | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer Container | Corning | 432000 | foam container designed to regulate temperature decrease |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX analysis software | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | SH30910 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Formaldehyde | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | ||
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) |
PerkinElmer | Optima 8000 | |
| Optical microscope | VWR | VistaVision | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| Scanning electronic microscope (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| surgical blade | VWR | 76353-728 | |
| Tissue Culture Flasks | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell inserts | Corning | 3460 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Trypsin-EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X-ray diffraction instrument (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
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