Dette manuskript beskriver en protokol til måling af den basale stofskifte og den oxidative kapacitet af termogeniske adipocytter hos overvægtige mus.
Målinger af energiforbrug er nødvendige for at forstå, hvordan ændringer i stofskiftet kan føre til fedme. Basal energiforbrug kan bestemmes i mus ved at måle hele kroppen iltforbrug, CO2-produktion , og fysisk aktivitet ved hjælp af metaboliske bure. Termogeniske brune/beige adipocytter (BA) bidrager væsentligt til gnaverenergiudgifterne, navnlig ved lave omgivelsestemperaturer. Her er målinger af basale energiforbrug og den samlede BA-kapacitet til at bruge energi på overvægtige mus beskrevet i to detaljerede protokoller: den første, der forklarer, hvordan analysen skal opsættes til måling af basale energiforbrug ved hjælp af analyse af kovarians (ANCOVA), en nødvendig analyse, da energiforbruget varierer med kropsmasse. Den anden protokol beskriver, hvordan ba-energiforbrugskapacitet in vivo måles hos mus. Denne procedure indebærer anæstesi, der er nødvendig for at begrænse udgifter forårsaget af fysisk aktivitet, efterfulgt af injektion af beta3-adrenergic agonist, CL-316,243, som aktiverer energiforbruget i BA. Disse to protokoller og deres begrænsninger er beskrevet i tilstrækkelig detaljer til at muliggøre et vellykket første eksperiment.
Metabolisme kan defineres som integration af de biokemiske reaktioner, der er ansvarlige for næringsstofoptagelse, opbevaring, transformation og nedbrydning, som celler bruger til at vokse og udføre deres funktioner. Metaboliske reaktioner omdanne energi indeholdt i næringsstoffer til en form, der kan bruges af celler til at syntetisere nye molekyler og udføre arbejde. Disse biokemiske reaktioner er i sagens natur ineffektive i at omdanne denne energi til en brugbar form til at opretholde livet1. En sådan ineffektivitet resulterer i energiafledning i form af varme, hvor denne varmeproduktion anvendes til at kvantificere standard metabolic rate (SMR) af en organisme1. Standardtilstanden blev klassisk defineret som varmeproduktion, der forekom hos en vågen, men hvilende voksen, ikke indtagelse eller fordøje mad, ved termoneutralitet og uden stress1. Basal metabolic rate (BMR) eller basal energiforbrug hos mus kaldes SMR, men hos personer, der indtager og fordøjer fødevarer under mild termisk stress (omgivelsestemperaturer 21-22 °C)1. Udfordringerne og vanskelighederne ved direkte at måle varmeproduktionen gjorde indirekte kalorimetri, nemlig beregning af varmeproduktion fra målinger af iltforbrug, til at blive den mest populære tilgang til bestemmelse af BMR. Beregning af BMR fra iltforbrug er mulig, fordi oxidation af næringsstoffer af mitokondrier til at syntetisere ATP er ansvarlig for 72% af den samlede ilt forbruges i en organisme, med 8% af det samlede iltforbrug også forekommer i mitokondrier, men uden at generere ATP (ukoblet respiration)1. Størstedelen af de resterende 20% af den ilt, der forbruges, kan tilskrives næringsoxidation på andre subcellulære steder (peroxisomal fedtsyreoxidation), anabolske processer og reaktiv iltartdannelse1. Således, i 1907, Lusk etableret en ligning, baseret på empiriske målinger, udbredt til at omdanne iltforbrug og CO2-produktion til energiafledning som varme. Hos mennesker, hjernen tegner sig for ~ 25% af BMR, bevægeapparatet for ~ 18,4%, leveren for ~ 20%, hjertet for ~ 10%, og fedtvæv for ~ 3-7%2. Hos mus er vævsbidraget til BMR lidt anderledes, med hjernen repræsenterer ~ 6,5%, skeletmusklen ~ 13%, leveren ~ 52%, hjertet ~ 3,7% og fedtvæv ~ 5%3.
Bemærkelsesværdigt er de biokemiske reaktioner, der definerer BMR, ikke faste og ændrer sig som reaktion på forskellige behov, såsom eksternt arbejde (fysisk aktivitet), udvikling (vævsvækst), indre belastninger (modvirkende infektioner, skader, vævsomsætning) og ændringer i omgivelsestemperaturen (koldt forsvar)1. Nogle organismer rekrutterer aktivt processer til at generere varme i kold eksponering, hvilket indebærer, at varme produceret af metabolisme ikke bare er et utilsigtet biprodukt. I stedet, evolution udvalgte reguleringsmekanismer, der specifikt kunne upregulate varmeproduktion ved at ændre hastigheden af metaboliske reaktioner1. Således kan de samme iltforbrugsmålinger bruges til at bestemme en organismes evne til at generere varme som reaktion på kulde.
To store processer bidrager til varmeproduktion ved kold eksponering. Den første er kuldegysninger, som genererer varme ved at øge mitokondrie oxidativ fosforylering og glykolyse i musklen til at dække det fysiske arbejde udført af ufrivillig muskelsammentrækning. Derfor vil kold eksponering øge iltforbruget i musklerne1. Den anden er ikke-rystende termogenese, som opstår gennem en stigning i iltforbruget i brune og beige adipocytter (BA). Spredning af energi til varme i BA medieres af mitokondrieafkoblingsprotein 1 (UCP1), som gør det muligt for proton genindtræden i mitokondriematrixen, hvilket reducerer mitokondrie protongradienten. Spredningen af mitokondrie proton gradient af UCP1 øger varmeproduktionen ved højden i elektron overførsel og iltforbrug og den energi, der frigives af proton spredning i sig selv uden at generere ATP (frakoblet). Desuden kan termogen BA rekruttere yderligere mekanismer, der hæver iltforbruget uden at forårsage en stor spredning i protongradienten ved at aktivere forgæves oxidative ATP-syntese- og forbrugscyklusser. De metaboliske bure, der er beskrevet her, nemlig CLAMS-Oxymax-systemet fra Columbus Instruments, giver mulighed for at måle energiforbruget ved forskellige omgivelsestemperaturer. For at bestemme BA’s termogeniske kapacitet ved hjælp af målinger af hele kroppens iltforbrug skal man imidlertid: (1) eliminere bidraget fra kulderystelser og andre ikke-BA-metaboliske processer til energiforbrug og (2) specifikt aktivere BA-termogen aktivitet in vivo. En anden protokol beskriver således, hvordan BA in vivo selektivt aktiveres ved hjælp af farmakologi i bedøvede mus ved termoneutralitet (30 °C), med anæstesi og termoneutralitet, der begrænser andre ikke-BA termogeniske processer (dvs. fysisk aktivitet). Den farmakologiske strategi for aktivering af BA behandler mus med den β3-adrenergic receptor agonist CL-316,246. Årsagen er, at kold eksponering fremmer en sympatisk reaktion frigive noradrenalin at aktivere β-adrenergic receptorer i BA, som aktiverer UCP1 og fedt oxidation. Desuden er β3-adrenergic receptor udtryk højt beriget i fedtvæv hos mus.
Indirekte kalorimetri har i årevis været anvendt til at vurdere hele kroppens energiforbrug4. Denne protokol beskrevet heri giver en enkel metode til måling af den basale stofskifte og bestemmelse BA termogen kapacitet in vivo ved hjælp af metaboliske bure.
Den indirekte kalorimetrimetode, der er beskrevet her, bekræfter, at det kan være vildledende at dividere energiomkostningsværdierne med kropsvægtværdier. For eksempel kan den konkludere, at energif…
The authors have nothing to disclose.
ML er finansieret af Institut for Medicin på UCLA, pilottilskud fra P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) og P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |