Denne artikel beskriver en protokol til at bestemme forskelle i basal redox tilstand og redox svar på akutte forstyrrelser i primære hippocampal og kortikale neuroner ved hjælp af konfokal levende mikroskopi. Protokollen kan anvendes på andre celletyper og mikroskoper med minimale ændringer.
Mitokondrie redox homøostase er vigtigt for neuronal levedygtighed og funktion. Selvom mitokondrier indeholder flere redox-systemer, betragtes den meget rigelige thiol-disulfid redox buffer glutathion som en central aktør i antioxidantforsvar. Derfor, måling af mitokondrie glutathion redox potentiale giver nyttige oplysninger om mitokondrie redox status og oxidativ stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) er et genetisk kodet, grønt fluorescerende protein (GFP)-baseret ratiometrisk indikator for glutathion redox-potentialet, der har to redox-state-følsomme excitation toppe ved 400 nm og 490 nm med en enkelt emissionstop ved 510 nm. Denne artikel beskriver, hvordan man udfører konfokal levende mikroskopi af mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primære hippocampal og kortikale neuroner. Den beskriver, hvordan man vurderer steady-state mitokondrie glutathion redox potentiale (f.eks at sammenligne sygdomstilstande eller langsigtede behandlinger) og hvordan man måler redox ændringer på akutte behandlinger (ved hjælp af excitotoksiske stof N-methyl-D-aspartat (NMDA) som et eksempel). Derudover præsenterer artiklen co-imaging af Grx1-roGFP2 og mitokondriemembranpotentialeindikatoren, tetramethylrhodamin, ethyl ester (TMRE), for at demonstrere, hvordan Grx1-roGPF2 kan multiplexes med yderligere indikatorer til multiparametriske analyser. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af, hvordan (i) optimerer confocal laser scanning mikroskop indstillinger, (ii) anvende lægemidler til stimulation efterfulgt af sensor kalibrering med diamid og dithiothreitol, og (iii) analysere data med ImageJ / FIJI.
Flere vigtige mitokondrie enzymer og signalmolekyler er underlagt thiol redox regulering1. Desuden er mitokondrier en vigtig cellulær kilde til reaktive iltarter og er selektivt sårbare over for oxidative skader2. Derfor mitokondrie redox potentiale direkte påvirker bioenergetik, celle signalering, mitokondrie funktion, og i sidste ende celle levedygtighed3,4. Mitokondrie matrix indeholder store mængder (1-15 mM) af thiol-disulfid redox buffer glutathion (GSH) for at opretholde redox homøostase og montere antioxidant forsvar5,6. GSH kan være kovalent knyttet til målproteiner (S-glutathionylation) for at kontrollere deres redox-status og aktivitet og bruges af en række afgiftende enzymer, der reducerer oxiderede proteiner. Derfor er mitokondrie glutathion redox potentiale en meget informativ parameter, når man studerer mitokondrie funktion og patofysiologi.
roGFP2 er en variant af GFP, der er blevet gjort redox-følsomme ved tilsætning af to overflade-eksponerede cysteiner, der danner en kunstig dithiol-disulfid par7,8. Det har en enkelt emission peak på ~ 510 nm og to excitation toppe på ~ 400 nm og 490 nm. Det er vigtigt, at de relative amplituder af de to excitationstoppe afhænger af roGFP2’s redox-tilstand (figur 1), hvilket gør dette protein til en ratiometrisk sensor. I Grx1-roGFP2 sensoren er human glutaredoxin-1 (Grx1) blevet smeltet til N-endestationen for roGFP29,10. Kovalent fastgørelse af Grx1-enzymet til roGFP2 giver to store forbedringer af sensoren: Det gør sensorresponset specifikt for GSH/GSSG glutathion redox-parret (figur 1), og det fremskynder ækvilibreringen mellem GSSG og roGFP2 med en faktor på mindst 100.0009. Derfor muliggør Grx1-roGFP2 specifik og dynamisk billeddannelse af det cellulære glutathion redox-potentiale.
Grx1-roGFP2 billeddannelse kan udføres på en bred vifte af mikroskoper, herunder widefield fluorescens mikroskoper, spinning disk konfokale mikroskoper, og laser scanning konfokale mikroskoper. Ekspression af sensoren i primære neuroner kan opnås ved forskellige metoder, der omfatter lipofection11, DNA / calcium-fosfat coprecipitation12, virusmedieret genoverførsel eller brug af transgene dyr som cellekilde (figur 2). Pseudotyped rekombinant adeno-associerede vira (rAAV), der indeholder en 1:1 forholdet mellem AAV1 og AAV2 capsid proteiner 13,14 blev brugt til eksperimenter i denne artikel. Med denne vektor, maksimal sensor udtryk er typisk nået 4-5 dage efter infektion og forbliver stabil i mindst to uger. Vi har med succes brugt Grx1-roGFP2 i primære hippocampale og kortikale neuroner fra mus og rotter.
I denne artikel, rAAV-medieret udtryk for mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primær rotte hippocampal og kortikale neuroner bruges til at vurdere basal mitokondrie glutathion redox tilstand og dens akutte forstyrrelser. En protokol er fastsat for confocal live imaging med detaljerede instruktioner om, hvordan (i) optimere laser scanning konfokale mikroskop indstillinger, (ii) køre en levende billedbehandling eksperiment, og (iii) analysere data med FIJI.
Kvantitative og dynamiske målinger af mitokondrie redox tilstand giver vigtige oplysninger om mitokondrie og cellulær fysiologi. Flere fluorogene kemiske sonder er tilgængelige, der registrerer reaktive iltarter, “redox stress” eller “oxidativ stress.” Sidstnævnte udtryk er imidlertid ikke veldefinerede og mangler ofte specificitet9,17,18. Sammenlignet med kemiske farvestoffer tilbyder Grx1-roGFP2 flere for…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. støttes af et ERASMUS+-stipendium. Vi takker Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner og Andrea Schlicksupp for forberedelsen af primære neuroner. Vi takker Dr. Tobias Dick for at levere pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Eksperimenter vist i figur 4 blev udført på Nikon Imaging Center, Universitetet i Heidelberg. Figur 2 blev udarbejdet med BioRender.com.
reagents | |||
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
equipment | |||
imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
software | |||
FIJI | https://fiji.sc | ||
StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |