Live Imaging af Mitokondrie Glutathione Redox tilstand i primære neuroner ved hjælp af en ratiometrisk indikator
Summary
Denne artikel beskriver en protokol til at bestemme forskelle i basal redox tilstand og redox svar på akutte forstyrrelser i primære hippocampal og kortikale neuroner ved hjælp af konfokal levende mikroskopi. Protokollen kan anvendes på andre celletyper og mikroskoper med minimale ændringer.
Abstract
Mitokondrie redox homøostase er vigtigt for neuronal levedygtighed og funktion. Selvom mitokondrier indeholder flere redox-systemer, betragtes den meget rigelige thiol-disulfid redox buffer glutathion som en central aktør i antioxidantforsvar. Derfor, måling af mitokondrie glutathion redox potentiale giver nyttige oplysninger om mitokondrie redox status og oxidativ stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) er et genetisk kodet, grønt fluorescerende protein (GFP)-baseret ratiometrisk indikator for glutathion redox-potentialet, der har to redox-state-følsomme excitation toppe ved 400 nm og 490 nm med en enkelt emissionstop ved 510 nm. Denne artikel beskriver, hvordan man udfører konfokal levende mikroskopi af mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primære hippocampal og kortikale neuroner. Den beskriver, hvordan man vurderer steady-state mitokondrie glutathion redox potentiale (f.eks at sammenligne sygdomstilstande eller langsigtede behandlinger) og hvordan man måler redox ændringer på akutte behandlinger (ved hjælp af excitotoksiske stof N-methyl-D-aspartat (NMDA) som et eksempel). Derudover præsenterer artiklen co-imaging af Grx1-roGFP2 og mitokondriemembranpotentialeindikatoren, tetramethylrhodamin, ethyl ester (TMRE), for at demonstrere, hvordan Grx1-roGPF2 kan multiplexes med yderligere indikatorer til multiparametriske analyser. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af, hvordan (i) optimerer confocal laser scanning mikroskop indstillinger, (ii) anvende lægemidler til stimulation efterfulgt af sensor kalibrering med diamid og dithiothreitol, og (iii) analysere data med ImageJ / FIJI.
Introduction
Flere vigtige mitokondrie enzymer og signalmolekyler er underlagt thiol redox regulering1. Desuden er mitokondrier en vigtig cellulær kilde til reaktive iltarter og er selektivt sårbare over for oxidative skader2. Derfor mitokondrie redox potentiale direkte påvirker bioenergetik, celle signalering, mitokondrie funktion, og i sidste ende celle levedygtighed3,4. Mitokondrie matrix indeholder store mængder (1-15 mM) af thiol-disulfid redox buffer glutathion (GSH) for at opretholde redox homøostase og montere antioxidant forsvar5,6. GSH kan være kovalent knyttet til målproteiner (S-glutathionylation) for at kontrollere deres redox-status og aktivitet og bruges af en række afgiftende enzymer, der reducerer oxiderede proteiner. Derfor er mitokondrie glutathion redox potentiale en meget informativ parameter, når man studerer mitokondrie funktion og patofysiologi.
roGFP2 er en variant af GFP, der er blevet gjort redox-følsomme ved tilsætning af to overflade-eksponerede cysteiner, der danner en kunstig dithiol-disulfid par7,8. Det har en enkelt emission peak på ~ 510 nm og to excitation toppe på ~ 400 nm og 490 nm. Det er vigtigt, at de relative amplituder af de to excitationstoppe afhænger af roGFP2’s redox-tilstand (figur 1), hvilket gør dette protein til en ratiometrisk sensor. I Grx1-roGFP2 sensoren er human glutaredoxin-1 (Grx1) blevet smeltet til N-endestationen for roGFP29,10. Kovalent fastgørelse af Grx1-enzymet til roGFP2 giver to store forbedringer af sensoren: Det gør sensorresponset specifikt for GSH/GSSG glutathion redox-parret (figur 1), og det fremskynder ækvilibreringen mellem GSSG og roGFP2 med en faktor på mindst 100.0009. Derfor muliggør Grx1-roGFP2 specifik og dynamisk billeddannelse af det cellulære glutathion redox-potentiale.
Grx1-roGFP2 billeddannelse kan udføres på en bred vifte af mikroskoper, herunder widefield fluorescens mikroskoper, spinning disk konfokale mikroskoper, og laser scanning konfokale mikroskoper. Ekspression af sensoren i primære neuroner kan opnås ved forskellige metoder, der omfatter lipofection11, DNA / calcium-fosfat coprecipitation12, virusmedieret genoverførsel eller brug af transgene dyr som cellekilde (figur 2). Pseudotyped rekombinant adeno-associerede vira (rAAV), der indeholder en 1:1 forholdet mellem AAV1 og AAV2 capsid proteiner 13,14 blev brugt til eksperimenter i denne artikel. Med denne vektor, maksimal sensor udtryk er typisk nået 4-5 dage efter infektion og forbliver stabil i mindst to uger. Vi har med succes brugt Grx1-roGFP2 i primære hippocampale og kortikale neuroner fra mus og rotter.
I denne artikel, rAAV-medieret udtryk for mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primær rotte hippocampal og kortikale neuroner bruges til at vurdere basal mitokondrie glutathion redox tilstand og dens akutte forstyrrelser. En protokol er fastsat for confocal live imaging med detaljerede instruktioner om, hvordan (i) optimere laser scanning konfokale mikroskop indstillinger, (ii) køre en levende billedbehandling eksperiment, og (iii) analysere data med FIJI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantitative og dynamiske målinger af mitokondrie redox tilstand giver vigtige oplysninger om mitokondrie og cellulær fysiologi. Flere fluorogene kemiske sonder er tilgængelige, der registrerer reaktive iltarter, “redox stress” eller “oxidativ stress.” Sidstnævnte udtryk er imidlertid ikke veldefinerede og mangler ofte specificitet9,17,18. Sammenlignet med kemiske farvestoffer tilbyder Grx1-roGFP2 flere for…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. støttes af et ERASMUS+-stipendium. Vi takker Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner og Andrea Schlicksupp for forberedelsen af primære neuroner. Vi takker Dr. Tobias Dick for at levere pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Eksperimenter vist i figur 4 blev udført på Nikon Imaging Center, Universitetet i Heidelberg. Figur 2 blev udarbejdet med BioRender.com.
Materials
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
Referências
- Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
- Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
- Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
- Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
- Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
- Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
- Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
- Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
- Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Bioquímica. 45 (7), 2362-2371 (2006).
- Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).
