Ultralyd-assisteret ekstraktion af cannabidiolsyre fra cannabis biomasse
Summary
Ultralydassisteret ekstraktion (UAE) øger ekstraktionseffektiviteten af opløsningsmidler, og når det påføres Cannabis spp. biomasse reducerer det den tid, der kræves til ekstraktion. Dette reducerer omkostningerne og det potentielle cannabinoidtab på grund af nedbrydning. Derudover betragtes UAE som en grøn metode på grund af lav opløsningsmiddelbrug.
Abstract
Industriel hamp (Cannabis spp.) har mange forbindelser af interesse med potentielle medicinske fordele. Af disse forbindelser er cannabinoider kommet i centrum for opmærksomheden, specifikt sure cannabinoider. Fokus er rettet mod sure cannabinoider på grund af deres mangel på psykotrop aktivitet. Cannabisplanter producerer sure cannabinoider med hampplanter, der producerer lave niveauer af psykotrope cannabinoider. Som sådan vil udnyttelse af hamp til sur cannabinoidekstraktion eliminere behovet for decarboxylering før ekstraktion som en kilde til cannabinoiderne. Anvendelsen af opløsningsmiddelbaseret ekstraktion er ideel til opnåelse af sure cannabinoider, da deres opløselighed i opløsningsmidler såsom superkritisk CO2 er begrænset på grund af det høje tryk og temperatur, der kræves for at nå deres opløselighedskonstanter. En alternativ metode designet til at øge opløseligheden er ultralydassisteret ekstraktion. I denne protokol er virkningen af opløsningsmiddelpolaritet (acetonitril 0,46, ethanol 0,65, methanol 0,76 og vand 1,00) og koncentration (20%, 50%, 70%, 90% og 100%) på ultralydassisteret ekstraktionseffektivitet blevet undersøgt. Resultaterne viser, at vand var det mindst effektive, og acetonitril var det mest effektive opløsningsmiddel, der blev undersøgt. Ethanol blev yderligere undersøgt, da det har den laveste toksicitet og generelt betragtes som sikkert (GRAS). Overraskende nok er 50% ethanol i vand den mest effektive ethanolkoncentration til ekstraktion af den højeste mængde cannabinoider fra hamp. Stigningen i cannabidiolsyrekoncentrationen var 28% sammenlignet med 100% ethanol og 23% sammenlignet med 100% acetonitril. Mens det blev fastslået, at 50% ethanol er den mest effektive koncentration til vores anvendelse, har metoden også vist sig at være effektiv med alternative opløsningsmidler. Derfor anses den foreslåede metode for effektiv og hurtig til ekstraktion af sure cannabinoider.
Introduction
Industriel hamp (Cannabis spp.) producerer sure cannabinoider i forskellige plantevæv (blomster, blade og stilke), med den højeste koncentration, der findes i blomsten1. Cannabisindustrien bruger flere metoder til at udvinde disse forbindelser. En sådan metode er opløsningsmiddelekstraktion, der anvender et ikke-polært og / eller polært opløsningsmiddel, hvoraf ethanol er den mest almindeligt anvendte. Imidlertid er opløsningsmiddelekstraktion alene begrænset i sin evne; derfor er augmentative ekstraktionsteknikker, såsom mikrobølgeassisteret ekstraktion (MAE) og ultralydassisteret ekstraktion (UAE), designet til at øge udbyttet. Derudover kan cannabidiol med høj koncentration (CBD) ekstraheres ved hjælp af superkritiske væsketeknologier2.
Ekstraktion er en dynamisk proces, og flere faktorer påvirker dens effektivitet, nemlig fugtindhold, partikelstørrelse og opløsningsmiddel3. Specifikt for UAE-teknikken styres effektiviteten af temperatur, tryk, frekvens og tid4.
Ultralydassisteret ekstraktion er den proces, hvor ultralydbølger ledes gennem en væske for at agitere partikler. Under omrøringsprocessen oplever plantematerialer akustisk kavitation, kompressions- og ekspansionscyklusser, der danner bobler, der kollapser i opløsning, hvilket resulterer i generering af ekstrem temperatur og tryk5. Tryk- og temperaturændringerne ændrer opløsningsmidlernes fysiske egenskaber, hvilket kan resultere i øget effekt af ekstraktion6. Derudover kan kavitation forstyrre molekylære interaktioner, der fører til organiske og uorganiske forbindelser, der udvaskes fraplantematrixen 7. Processen involverer to hovedtyper af fysiske fænomener: (1) diffusion over cellevæggen og (2) skylning af det cellulære indhold efter at have brudt væggen8. Brugen af UAE er dog ikke uden faldgruber; der er flere rapporter om, at UAE kan nedbryde forbindelser 9,10. Derudover er de temperaturer, der genereres på kavitationsstederne, over dem, der er nødvendige for decarboxylering af cannabinoider. Mudge et al.11 brugte imidlertid UAE og observerede ikke stor decarboxylering af CBD eller tetrahydrocannabinol (THC), hvilket viser, at UAE er en effektiv og grøn metode til udvinding af cannabinoider, da de hurtigt kan ekstraheres ved hjælp af lav energi.
De Vita et al.12 undersøgte brugen af MAE- og UAE-metoder specifikt og fandt ud af, at UAE ved anvendelse af de optimale betingelser for hver metode ekstraherede mere af den sure og neutrale CBD og THC, der var til stede i plantematerialet. Tilsvarende sammenlignede Rožanc et al.13 flere ekstraktionsmetoder (UAE, soxhlet, maceration og superkritisk væske) og undersøgte ekstrakternes biologiske aktivitet. Rožanc demonstrerede, at alle metoderne var effektive til at udvinde cannabinoider; men superkritisk væske og UAE var mest effektive til ekstraktion af cannabidiolsyre (CBDA). Derudover havde UAE-ekstraktionen den højeste biologiske aktivitet målt ved 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay. Rožancs undersøgelse viste også, at mens ekstraktionsprocesserne er effektive til at producere råekstrakter, er der stadig en del af ikke-cannabinoide forbindelser, der påvirker ekstrakternes biologiske aktivitet. Derudover kan disse forbindelser komplicere isoleringen og oprensningen af individuelle cannabinoidforbindelser fra de rå ekstrakter13.
Superkritisk væskeekstraktion (SFE) teknikker er blevet brugt til at udvinde neutrale cannabinoider. Flere undersøgelser viste, at SFE plus et organisk opløsningsmiddel, såsom ethanol, resulterede i højere ekstraktionseffektivitet af neutrale cannabinoider 2,3. Da trykket blev øget til niveauer, der var i stand til at udvinde de sure cannabinoider, steg ikke-cannabinoidindholdet også. Som sådan er disse høje tryk ikke praktiske til industriel forarbejdning, da selektiviteten af SFE for cannabinoider faldt, og yderligere efterbehandling er påkrævet. Derfor skal decarboxylering udføres før SFE, hvilket kan resultere i cannabinoidtab på op til 18% 2. For at øge effektiviteten i SFE er det blevet kombineret med teknikker såsom fastfaseekstraktion for at øge renheden af det endelige ekstrakt14. På trods af at have høj renhed som det endelige produkt, opnås kun neutrale cannabinoider.
Traditionelt blev cannabinoider i det analytiske laboratorium ekstraheret i en 9: 1 methanol: chloroformblanding. Mudge et al.11 viste imidlertid, at effektiv ekstraktion kan udføres med enkelte opløsningsmidler, når der anvendes UAE. Undersøgelsen viste, at 80% methanol var lige så effektivt som den traditionelle 9:1 methanol:chloroformekstraktion, hvilket indikerer, at grønnere opløsningsmidler kan være lige så effektive. Som sådan blev UAE undersøgt for dets potentielle anvendelse på grund af at have flere fordele, herunder lave kapitalomkostninger, reduceret ekstraktionstid og lavere energiforbrug og opløsningsmiddelmængder. Men i tilfælde af UAE, når polære opløsningsmidler anvendes, kan klorofyl og andre ikke-cannabinoider ekstraheres, hvilket kan forårsage et problem i farve7. For at undersøge potentialet for at opnå sure cannabinoider i kommerciel skala blev UAE derfor ansat ved hjælp af den industrielle hampesort Cherry Wine. Cherry Wine er en hybrid af C. sativa og C. indica, en krydsning mellem sorterne The Wife og Charlotte’s Cherries. Kirsebærvinssorten er en høj CBDA-producerende stamme (15% til 25% CBD) med lave niveauer af tetrahydrocannaginolsyre (THCA). Sorten er en C. indica-dominerende stamme, der har 7 til 9 ugers blomstring.
For at etablere den optimale UAE-ekstraktionsprotokol blev der taget to tilgange: den traditionelle optimering af en faktor ad gangen (OFT) og en Design of Experiment (DoE) tilgang ved hjælp af en Central Composite Design (CCD)15. For DoE blev CBDA / CBD-ekstraktion optimeret baseret på prøve / opløsningsmiddelforholdet, ekstraktionstiden og opløsningsmiddelkoncentrationen som faktorer, og de resulterende data blev analyseret af Response Surface Methodology (RSM). Afslutningsvis skitserer den beskrevne protokol den optimale metode til ekstraktion af den højeste mængde CBDA / CBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polariteten af et opløsningsmiddel spiller en kritisk rolle i den effektive ekstraktion af forbindelser. Da sure cannabinoider er lidt polære i naturen, hvilket i vid udstrækning skyldes carboxylsyren, blev det antaget, at et polært opløsningsmiddel som methanol eller ethanol ville være mest effektivt. Garrett og Hunt19 viste i deres undersøgelse ved hjælp af THC, at opløseligheden i vandig ethanol var baseret på procent ethanol i opløsningen og ionstyrken af opløsningen. Mens ionstyrk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Institute of Cannabis Research ved Colorado State University-Pueblo, Korea Innovation Foundation-tilskuddet finansieret af den koreanske regering (MSIT) (2021-DD-UP-0379) og Chuncheon by (Hamp F & U og industrialisering, 2020-2021).
Materials
| Acetonitrile | J.K.Baker | 9017-88 | solvent |
| Cannabichromene | Cerilliant | C-143 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiol | Cerilliant | C-045 | Cannabinoids standard |
| Cannabidiolic acid | Cerilliant | C-144 | Cannabinoids standard |
| Cannabidivarin | Cerilliant | C-140 | Cannabinoids standard |
| Cannabigerol | Cerilliant | C-141 | Cannabinoids standard |
| Cannabinol | Cerilliant | C-046 | Cannabinoids standard |
| Centrifuge | Hanil Scientific Inc | Supra 22K | Centrifuge |
| Cherry Wine hemp | CFH, Ltd. | – | Flower extraction material |
| Distilled water | TEDIA | WS2211-001 | solvent |
| Ethanol | TEDIA | ES1431-001 | solvent |
| Filter paper | Whatman | #2 | Filtering |
| Grinder | Daesung Artlon | DA280-S | Milling |
| HPLC | Shimadzu | LC-10 system | Analysis of Cannabinoid |
| Methanol | TEDIA | MS1922-001 | solvent |
| Minitab 16.2.0 | Minitab Inc. | ||
| Syringe filters | Whatman | 6779-1304 | Filtering |
| Tetrahydrocannabivarin | Cerilliant | T-094 | Cannabinoids standard |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-aldrich | 302031-1L | HPLC flow solvent |
| Untrasonic bath | Jinwoo | 4020P | Ultrasonic extraction |
| Zorbax Eclipse plus C18 HPLC column | Agilent | 9599990-902 | HPLC column |
| Δ8 – Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-032 | Cannabinoids standard |
| Δ9 – Tetrahydrocannabinol | Cerilliant | T-005 | Cannabinoids standard |
| Δ9 – Tetrahydrocannabinolic acid | Cerilliant | T-093 | Cannabinoids standard |
Referências
- Hemphill, J. K., Turner, J. C., Mahlberg, P. G. Cannabinoid content of individual plant organs from different geographical strains of Cannabis sativa L. Journal of Natural Products. 43 (1), 112-122 (1980).
- Baldino, L., Scognamiglio, M., Reverchon, E. Supercritical fluid technologies applied to the extraction of compounds of industrial interest from Cannabis sativa L. and to their pharmaceutical formulations: A review. Journal of Supercritical Fluids. 165, 104960 (2020).
- Daniel, R. G., et al. Supercritical extraction strategies using CO2 and ethanol to obtain cannabinoid compounds from cannabis hybrid flowers. Journal of CO2 Utilization. 30, 241-248 (2019).
- Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review. Journal of Food Engineering. 117 (4), 426-436 (2013).
- Ohl, C. D., Kurz, T., Geisler, R., Lindau, O., Lauterborn, W. Bubble dynamics, shock waves and sonoluminescence. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 357 (1751), 269-294 (1999).
- Castro-Puyana, M., Marina, M. L., Plaza, M. Water as green extraction solvent: Principles and reasons for its use. Current Opinion in Green and Sustainable Chemistry. 5, 31-36 (2017).
- Herrera, M. C., De Castro, M. L. Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from strawberries prior to liquid chromatographic separation and photodiode array ultraviolet detection. Journal of Chromatography A. 1100 (1), 1-7 (2005).
- Mason, T. J., Paniwnyk, L., Lorimer, J. P. The uses of ultrasound in food technology. Ultrasonics Sonochemistry. 3 (3), 253-260 (1996).
- Soares, V. P., et al. Ultrasound assisted maceration for improving the aromatization of extra-virgin olive oil with rosemary and basil. Food Research International. 135, 109305 (2020).
- Kshitiz, K., et al. Ultrasound assisted extraction (UAE) of bioactive compounds from fruit and vegetable processing by-products: A review. Ultrasinics Sonochemistry. 70, 105325 (2017).
- Mudge, E. M., Murch, S. J., Brown, P. N. Leaner and greener analysis of cannabinoids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (12), 3153-3163 (2017).
- De Vita, D., et al. Comparison of different methods for the extraction of cannabinoids from cannabis. Natural Product Research. 34 (20), 2952-2958 (2020).
- Rožanc, J., et al. Different Cannabis sativa extraction methods result in different biological activities against a colon cancer cell line and healthy colon cells. Plants. 10 (3), 566 (2021).
- Karğili, U., Aytaç, E. Supercritical fluid extraction of cannabinoids (THC and CBD) from four different strains of cannabis grown in different regions. The Journal of Supercritical Fluids. 179, 105410 (2022).
- Sushma, C., et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction (UAE) process for the recovery of bioactive compounds from bitter gourd using response surface methodology (RSM). Food and Bioproducts Processing. 120, 120-122 (2022).
- David, J. P., et al. Potency of Δ9-THC and Other Cannabinoids in Cannabis in England in 2005: Implications for Psychoactivity and Pharmacology. Journal of Forensic Sciences. 11, 129 (2008).
- Agarwal, C., Máthé, K., Hofmann, T., Csóka, L. Ultrasound-assisted extraction of cannabinoids from Cannabis Sativa L. optimized by response surface methodology. Journal of Food Science. 83 (3), 700-710 (2018).
- Oroian, M., Ursachi, F., Dranca, F. Influence of ultrasonic amplitude, temperature, time and solvent concentration on bioactive compounds extraction from propolis. Ultrasonics Sonochemistry. 64 (2020), 105021 (2020).
- Garrett, E. R., Hunt, A. Physiochemical properties, solubility, and protein binding of Δ9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 63 (7), 1056-1064 (1974).
- Metcalf, D. G. Chemical Abstracts. United States patent. , (2020).
- Lazarjani, M. P., Young, O., Kebede, L., et al. Processing and extraction methods of medicinal cannabis: a narrative review. Journal of Cannabis Research. 3 (1), 1-15 (2021).
- Lewis-Bakker, M. M., Yang, Y., Vyawahare, R., Kotra, L. P. Extractions of medical cannabis cultivars and the role of decarboxylation in optimal receptor responses. Cannabis and Cannabinoid Research. 4 (3), 183-194 (2019).
- Brighenti, V., Pellati, F., Steinbach, M., Maran, D., Benvenuti, S. Development of a new extraction technique and HPLC method for the analysis of non-psychoactive cannabinoids in fibre-type Cannabis sativa L.(hemp). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 143, 228-236 (2017).
- . FDA Available from: https://www.cfsanappsexternal.fda.gov/scripts/fdcc/?set=SCOGS (2021)
- Rae, J., et al. Estimation of ultrasound induced cavitation bubble temperatures in aqueous solutions. Ultrasonics Sonochemistry. 12, 325-329 (2005).
- Moreno, T., Montanes, F., Tallon, S. J., Fenton, T., King, J. W. Extraction of cannabinoids from hemp (Cannabis sativa L.) using high pressure solvents: An overview of different processing options. Journal of Supercritical Fluids. 161, 104850 (2020).
- Zhang, Q. W., Lin, L. G., Ye, W. C. Techniques for extraction and isolation of natural products: a comprehensive review. Chinese Medicine. 13 (20), 1-26 (2018).
- Fathordoobady, F., Singh, A., Kitts, D. D., Singh, A. P. Hemp (Cannabis sativa L.) extract: Anti-microbial properties, methods of extraction, and potential oral delivery. Food Reviews International. 35 (7), 664-684 (2019).
