Extração ultrassônica assistida de ácido canabidiolico da biomassa da cannabis

Summary

A extração ultrassônica assistida (EAU) aumenta a eficiência de extração de solventes e, quando aplicada à cannabis spp. biomassa, reduz o tempo necessário para a extração. Isso diminui o custo e a perda potencial de canabinoides devido à degradação. Além disso, os Emirados Árabes Unidos são considerados um método verde devido ao baixo uso de solventes.

Abstract

O cânhamo industrial (Cannabis spp.) tem muitos compostos de interesse com potenciais benefícios médicos. Desses compostos, os canabinóides chegaram ao centro das atenções, especificamente canabinóides ácidos. O foco está se voltando para canabinóides ácidos devido à falta de atividade psicotrópica. Plantas de cannabis produzem canabinóides ácidos com plantas de cânhamo produzindo baixos níveis de canabinoides psicotrópicos. Como tal, a utilização do cânhamo para extração ácida de canabinoides eliminaria a necessidade de descarboxingação antes da extração como fonte para os canabinóides. O uso da extração à base de solventes é ideal para a obtenção de canabinoides ácidos, pois sua solubilidade em solventes como o CO₂ supercrítica é limitada devido à alta pressão e temperatura necessária para atingir suas constantes de solubilidade. Um método alternativo projetado para aumentar a solubilidade é a extração assistida por ultrassom. Neste protocolo, foi examinado o impacto da polaridade solvente (acetonitrilo 0,46, etanol 0,65, metanol 0,76 e água 1,00) e concentração (20%, 50%, 70%, 90% e 100%) na eficiência de extração assistida por ultrassom. Os resultados mostram que a água foi a menos eficaz e a acetonitrila foi o solvente mais eficaz examinado. O etanol foi examinado ainda mais, pois tem a menor toxicidade e é geralmente considerado seguro (GRAS). Surpreendentemente, 50% de etanol na água é a concentração de etanol mais eficaz para extrair a maior quantidade de canabinóides do cânhamo. O aumento da concentração de ácido canabidílico foi de 28% em relação ao 100% etanol, e 23% quando comparado com 100% de acetonitrilo. Embora tenha sido determinado que 50% do etanol é a concentração mais eficaz para nossa aplicação, o método também tem demonstrado ser eficaz com solventes alternativos. Consequentemente, o método proposto é considerado eficaz e rápido para a extração de canabinoides ácidos.

Introduction

O cânhamo industrial (Cannabis spp.) produz canabinoides ácidos em diversos tecidos vegetais (flores, folhas e caules), com a maior concentração encontrada na flor¹. A indústria da Cannabis utiliza vários métodos para extrair esses compostos. Um desses métodos é a extração de solventes que utiliza um solvente não polar e/ou polar, do qual o etanol é o mais utilizado. No entanto, a extração de solventes por si só é limitada em sua capacidade; portanto, técnicas de extração aumentada, como extração assistida por micro-ondas (MAE) e extração assistida por ultrassom (EAU), são projetadas para aumentar o rendimento. Além disso, o canabidiol de alta concentração (CBD) pode ser extraído usando tecnologias de fluidos supercríticos².

A extração é um processo dinâmico, e vários fatores influenciam sua eficiência, ou seja, teor de umidade, tamanho de partículas e solvente³. Especificamente, para a técnica dos Emirados Árabes Unidos, a eficiência é regida pela temperatura, pressão, frequência e tempo⁴.

Extração ultrassônica assistida é o processo onde ondas ultrassônicas são passadas através de um líquido para agitar partículas. Durante o processo de agitação, os materiais vegetais experimentam cavitação acústica, ciclos de compressão e expansão que formam bolhas que colapsam em solução resultando na geração de temperatura extrema e pressão⁵. As mudanças de pressão e temperatura alteram as propriedades físicas dos solventes, o que pode resultar em maior eficácia da extração⁶. Além disso, a cavitação pode interromper as interações moleculares que levam a compostos orgânicos e inorgânicos que lixiviam da matriz vegetal⁷. O processo envolve dois tipos principais de fenômenos físicos: (1) difusão através da parede celular, e (2) enxaguar o conteúdo celular após quebrar a parede⁸. No entanto, o uso dos Emirados Árabes Unidos não é sem suas armadilhas; há vários relatos de que os Emirados Árabes Unidos podem degradar compostos ^9,10. Além disso, as temperaturas geradas nos locais de cavitação estão acima das necessárias para a descarboxingação de canabinóides. No entanto, Mudge et ^al.11 usaram os Emirados Árabes Unidos e não observaram grande descarboxingação de CBD ou tetrahidrocanabinol (THC), demonstrando assim que os Emirados Árabes Unidos são um método eficiente e verde para a extração de canabinoides, uma vez que podem ser extraídos rapidamente usando baixa energia.

De Vita et ^al.12 examinaram especificamente o uso de métodos MAE e Emirados Árabes Unidos e descobriram que, ao aplicar as condições ideais para cada método, os Emirados Árabes Unidos extrairam mais do CBD ácido e neutro e THC presente no material vegetal. Da mesma forma, Rožanc et ^al.13 compararam múltiplos métodos de extração (Emirados Árabes Unidos, soxhlet, maceração e fluido supercrítico) e examinaram a atividade biológica dos extratos. Rožanc demonstrou que todos os métodos foram eficazes na extração de canabinoides; no entanto, fluido supercrítico e Emirados Árabes Unidos foram mais eficazes na extração de ácido canabidiolico (CBDA). Além disso, a extração dos Emirados Árabes Unidos teve a maior atividade biológica quando medida pelo ensaio 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH). O estudo de Rožanc também mostrou que, embora os processos de extração sejam eficazes na produção de extratos brutos, permanece uma porção de compostos não canabinoides que influenciam a atividade biológica dos extratos. Além disso, esses compostos podem complicar o isolamento e purificação de compostos canabinoides individuais dos extratos brutos¹³.

Técnicas de extração de fluidos supercríticos (SFE) têm sido usadas para extrair canabinoides neutros. Vários estudos demonstraram que a SFE mais um solvente orgânico, como o etanol, resultou em maior eficiência de extração de canabinóides neutros ^2,3. Quando a pressão foi aumentada para níveis capazes de extrair os canabinoides ácidos, o conteúdo não canabinoide também aumentou. Como tal, essas altas pressões não são práticas para o processamento industrial, pois a seletividade da SFE para canabinoides diminuiu e é necessário um pós-processamento adicional. Consequentemente, a descarboxingação deve ser feita antes da SFE, o que pode resultar em perdas canabinoides de até 18%². Para aumentar a eficiência na SFE, foi combinado com técnicas como extração em fase sólida para aumentar a pureza do extrato final¹⁴. No entanto, apesar de ter alta pureza como produto final, apenas canabinoides neutros são obtidos.

Tradicionalmente, no laboratório analítico, os canabinóides eram extraídos em uma mistura de metanol:clorofórmio 9:1. No entanto, Mudge et ^al.11 demonstraram que a extração efetiva pode ser realizada com solventes únicos ao empregar os Emirados Árabes Unidos. O estudo mostrou que 80% de metanol foi tão eficaz quanto a tradicional extração de metanol 9:1:clorofórmio, indicando assim que solventes mais verdes podem ser tão eficazes. Como tal, os Emirados Árabes Unidos foram examinados por seu potencial uso devido a vários benefícios, incluindo baixo custo de capital, redução do tempo de extração e menor uso de energia e volumes de solventes. No entanto, no caso dos Emirados Árabes Unidos, quando solventes polares são usados, clorofila e outros não-canabinóides podem ser extraídos, o que pode causar um problema na cor⁷. Consequentemente, para examinar o potencial de obtenção de canabinoides ácidos em escala comercial, os Emirados Árabes Unidos foram empregados usando a variedade industrial de cânhamo Cherry Wine. Cherry Wine é um híbrido de C. sativa e C. indica, um cruzamento entre as variedades de The Wife e Charlotte’s Cherries. A variedade Cherry Wine é uma cepa de produção de CBDA alta (15% a 25% CBD) com baixos níveis de ácido tetrahidrocanabinolic (THCA). A variedade é uma cepa C. indica-dominate que tem de 7 a 9 semanas de floração.

Para estabelecer o protocolo de extração ideal dos Emirados Árabes Unidos, foram tomadas duas abordagens: o fator tradicional de cada vez (OFT) e uma abordagem de Design of Experiment (DoE) usando um Design Composto Central (CCD)¹⁵. Para o DoE, a extração CBDA/CBD foi otimizada com base na relação amostra/solvente, tempo de extração e concentração de solventes como fatores, e os dados resultantes foram analisados pela Response Surface Methodology (RSM). Em conclusão, o protocolo descrito descreve o método ideal para extrair a maior quantidade de CBDA/CBD.

Protocol

1. Preparação do material vegetal Obtenha inflorescências de Cerejeira de plantas cultivadas no campo, plantadas em uma configuração sul-norte, com plantas de 1 m de distância no centro e fileiras de 1,2 m de distância (cultivo localizado em Longmont, Colorado, EUA). Seque as inflorescências a 35 °C por 48 h. Triture as inflorescências usando uma máquina de moagem de 177 μm. Passe o material pulverizado através da peneira de malha nº 80. Armazene o pó resultan…

Representative Results

Os solventes utilizados variam do médio do índice de polaridade (0,460 – ACN) ao polar (1.000 – água). A partir da Tabela 2, pode-se ver que a água não fez um extrator eficaz para os canabinoides, o que não é inesperado, pois os canabinóides têm solubilidade limitada na água devido à sua hidroofobidade13. Em contraste com a água, os outros solventes apresentaram valores extraídos similares de CBD e CBDA, com o menor acetonitrilo solvente polar (ACN) tendo maior extra?…

Discussion

A polaridade de um solvente desempenha um papel crítico na efetiva extração de compostos. Uma vez que as canabinóides ácidas são ligeiramente polares na natureza, devido em grande parte à moiety ácido carboxílico, assumiu-se que um solvente polar como o metanol ou o etanol seria mais eficaz. Garrett e Hunt¹⁹, em seu estudo usando THC, demonstraram que a solubilidade no etanol aquoso foi baseada em percentual de etanol na solução e força iônica da solução. Embora a força iônica nã…

Materials

Acetonitrile	J.K.Baker	9017-88	solvent
Cannabichromene	Cerilliant	C-143	Cannabinoids standard
Cannabidiol	Cerilliant	C-045	Cannabinoids standard
Cannabidiolic acid	Cerilliant	C-144	Cannabinoids standard
Cannabidivarin	Cerilliant	C-140	Cannabinoids standard
Cannabigerol	Cerilliant	C-141	Cannabinoids standard
Cannabinol	Cerilliant	C-046	Cannabinoids standard
Centrifuge	Hanil Scientific Inc	Supra 22K	Centrifuge
Cherry Wine hemp	CFH, Ltd.	–	Flower extraction material
Distilled water	TEDIA	WS2211-001	solvent
Ethanol	TEDIA	ES1431-001	solvent
Filter paper	Whatman	#2	Filtering
Grinder	Daesung Artlon	DA280-S	Milling
HPLC	Shimadzu	LC-10 system	Analysis of Cannabinoid
Methanol	TEDIA	MS1922-001	solvent
Minitab 16.2.0	Minitab Inc.
Syringe filters	Whatman	6779-1304	Filtering
Tetrahydrocannabivarin	Cerilliant	T-094	Cannabinoids standard
Trifluoroacetic acid	Sigma-aldrich	302031-1L	HPLC flow solvent
Untrasonic bath	Jinwoo	4020P	Ultrasonic extraction
Zorbax Eclipse plus C18 HPLC column	Agilent	9599990-902	HPLC column
Δ8 – Tetrahydrocannabinol	Cerilliant	T-032	Cannabinoids standard
Δ9 – Tetrahydrocannabinol	Cerilliant	T-005	Cannabinoids standard
Δ9 – Tetrahydrocannabinolic acid	Cerilliant	T-093	Cannabinoids standard