JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioquímica

Uracil-DNA-glycosylaseassay ved matrixassisteret laserdesorption/ionisering Time-of-flight Massespektrometrianalyse

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

En ikke-mærket, ikke-radio-isotopisk metode til assay uracil-DNA-glycosylaseaktivitet blev udviklet ved anvendelse af MALDI-TOF massespektrometri til direkte apurinisk/ apyrimidinisk stedholdig produktanalyse. Assayet viste sig at være ret simpelt, specifikt, hurtigt og let at bruge til DNA-glycosylasemåling.

Abstract

Uracil-DNA-glycosylase (UDG) er en nøglekomponent i baseudskæringsreparationsvejen til korrektion af uracil dannet ved hydrolytisk deaminering af cytosin. Det er således afgørende for vedligeholdelse af genomintegritet. En meget specifik, ikke-mærket, ikke-radio-isotopisk metode blev udviklet til at måle UDG-aktivitet. En syntetisk DNA-duplex indeholdende en stedsspecifik uracil blev spaltet af UDG og derefter underkastet Matrix-assisteret laserdesorption/ioniseringstid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) analyse. En protokol blev etableret for at bevare det apuriniske / apyrimidiniske sted (AP) produkt i DNA uden strengbrud. Ændringen i m/z-værdien fra substratet til produktet blev anvendt til at evaluere uracilhydrolyse ved UDG. Et G: U-substrat blev anvendt til UDG-kinetisk analyse, der gav Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM / s og Kcat = 9,31 s-1. Anvendelse af denne metode på en uracil glycosylasehæmmer (UGI) assay gav en IC50-værdi på 7,6 pM. UDG-specificiteten ved anvendelse af uracil på forskellige positioner inden for enkeltstrengede og dobbeltstrengede DNA-substrater viste forskellige spaltningseffektiviteter. Således kan denne enkle, hurtige og alsidige MALDI-TOF MS-metode være en glimrende referencemetode til forskellige monofunktionelle DNA-glycosylaser. Det har også potentialet som et redskab til SCREENING AF DNA-glycosylasehæmmere.

Introduction

Selvom uracil er en normal base i RNA, er det en almindelig og meget mutagent læsion i genomisk DNA. Uracil kan opstå ved spontan/enzymatisk hydrolytisk deaminering af en deoxycytidin. I hver levende celle forekommer denne deaminering 100-500 gange om dagen under fysiologiske forhold1,2. Hvis disse ændringer ikke repareres, kan der være en ændring i DNA-sekvenssammensætningen, hvilket forårsager mutation. Da uracil i DNA foretrækker at parre sig med dATP under replikation, hvis cytosin deaminerer til uracil, vil der i to replikationshændelser være en ny G: C til A: T overgangsmutation i halvdelen af afkom DNA3.

Blandt de cellulære strategier til opretholdelse af genetisk stabilitet er base excision repair (BER) en væsentlig mekanisme, der reparerer beskadigede baser, såsom uracil, i DNA4. BER er en meget evolutionært bevaret proces. Der er to generelle BER-veje: den korte patchvej, der fører til en reparationskanal af et enkelt nukleotid, og den lange patchvej, der producerer en reparationskanal på mindst to nukleotider5. BER er en koordineret mekanisme, der forekommer i flere trin. Det første trin i BER er den enzymatiske hydrolyse af den beskadigede nukleotidbase ved hjælp af en skadesspecifik DNA-glycosylase for at generere et apurinisk/apyrimidinisk (AP) mellemliggende sted6. Dette efterfølges af spaltningen af sukkerfosfatrygraden på AP-stedet af en endonuklease, oprydning af DNA-enderne med en lyase, gap-fyldning af en DNA-polymerase og forsegling af det endelige nick med en ligase5.

Uracil-DNA-glycosylase (UDG) hydrolyserer uracil fra uracilholdigt DNA til BER i Escherichia coli. Konventionelle UDG-assays ved hjælp af radioaktivt mærket DNA, der involverer forskellige separationsteknikker6,7,8,9,10,11,12,13, er normalt tidskrævende, arbejdskrævende, med dyre mærkningsreagenser, komplicerede procedurer og kræver intensiv træning og praksis for at reducere risikoen for eksponering for radioaktive materialer. Fluorometriske oligonukleotidassays er udviklet som erstatning for radioisotopmærkning14, ud over molekylære fyrtårne og Förster resonansenergioverførselsteknologi15,16,17,18,19,20. Der kræves dog specifik mærkning for alle ovennævnte metoder. For nylig er der udviklet etiketfrie biosensorer assays21,22,23 og kolorimetriske metoder baseret på dannelsen af en G-quadruplex24,25,26. Imidlertid komplicerer flere A: U-par eller specielt designede sekvenser i sonderne enzymenhedsdefinitionen.

MALDI-TOF MS er en teknologi, der kan være til stor nytte i DNA-analyse. Udviklede anvendelser omfatter enkeltnukleotidpolymorfisme genotyping27,28, modificeret nukleotidanalyse29 og DNA-reparation mellemidentifikation30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS bør let anvendes til DNA-glycosylaseanalyse til påvisning af AP-site-holdige DNA-produkter. AP-steder i DNA er imidlertid tilbøjelige til at bryde streng under mange eksperimentelle forhold33. Et UDG-assay præsenteres her ved hjælp af MALDI-TOF MS til direkte måling af AP-produktionsstedet uden betydelig strengbrudsstøj. Denne etiketfri metode er let at arbejde med og har et stort potentiale for farmaceutisk anvendelse af DNA-glycosylasehæmmerscreening.

Protocol

1. Forberedelse af substrat/skabelon Design uracil substrat/skabelon duplex med et afbalanceret G + C indhold på ~ 50 ± 10% og minimum smeltetemperatur på 50 ° C for duplex regionen.BEMÆRK: En nukleotidforskel mellem 18 nt substrater og 19 nt skabeloner (tabel 1 og figur 1) hjælper med bedre MS signalfortolkning og passende udglødning. Skabelonstrengen fungerer som komplementært DNA til at generere A-U- eller G-U-mismatch (tabel…

Representative Results

Skabeloner og underlagVed at tage syntetiske oligonukleotider med U i midten (U + 9) parret med en G-skabelon som et eksempel (figur 1A) kan en tom kontrol af ækvivalarmængder af skabelon og uracilholdigt substrat anvendes til kvalitetskontrol af syntetisk oligonukleotidrenhed (figur 1B; signalerne matcher den udpegede m / z og den lave baggrundsstøj). I analysen af MS-dataene blev tophøjderne målt (figur 2…

Discussion

Dette papir indeholder en detaljeret procedure for anvendelse af en UDG MALDI-TOF MS-analysemetode til direkte påvisning af AP-holdige DNA-produkter. De vigtigste fordele ved denne metode er, at uracilholdige substrater er etiketfrie, skalerbare, nemme at arbejde med og giver større fleksibilitet i substratdesign.

Den UDG-leverandøranbefalede phenol/chloroformekstraktion muliggør inaktivering af enzymet for at forhindre nedbrydning af produkt-DNA. Phenolekstraktionsprotokollen involverer i…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) og NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan, R.O.C. [tilskudsnummer MOST109-2314-B-002 -186 til K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 til S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 til W.-h.F.]. H.-L.C. er modtager af et ph.d.-stipendium fra National Taiwan University. Finansiering af open access-afgift: Ministeriet for Videnskab og Teknologi, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Bioquímica. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Bioquímica. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O’Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Bioquímica. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination
check_url/pt/63089?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image