Este estudo apresenta um protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D aplicado a uma linhagem celular pediátrica de glioma difuso da linha média, útil para estudar em tempo real a expressão de proteínas na membrana plasmática durante processos dinâmicos como invasão e migração de células 3D.
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Artigo de método
Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A migração e invasão celular são características específicas dos tumores mutantes H3K27M de glioma difuso da linha média (DMG). Já modelamos essas características usando ensaios tridimensionais (3D) de invasão e migração baseados em células. Neste estudo, otimizamos esses ensaios 3D para imunocitoquímica de células vivas. Um Antibody Labeling Reagent foi usado para detectar em tempo real a expressão da molécula de adesão CD44, na membrana plasmática de células migratórias e invasoras de uma linhagem celular primária derivada de paciente DMG H3K27M. O CD44 está associado ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de células tumorais e está envolvido nas interações diretas com a matriz extracelular do sistema nervoso central (SNC). As neuroesferas (NS) da linhagem celular DMG H3K27M foram embutidas na matriz de membrana basal (BMM) ou colocadas em uma fina camada de revestimento de BMM, na presença de um anticorpo anti-CD44 em conjunto com o reagente de marcação de anticorpos (ALR). A análise de imagens imunocitoquímicas de células vivas em 3D foi realizada em um instrumento de análise de células vivas para medir quantitativamente a expressão global de CD44, especificamente nas células migrantes e invasoras. O método também permite visualizar em tempo real a expressão intermitente de CD44 na membrana plasmática de células migratórias e invasoras. Além disso, o ensaio também forneceu novos conhecimentos sobre o papel potencial do CD44 na transição mesenquimal para ameboide em células DMG H3K27M.
Introdução
A capacidade das células tumorais de evadir e disseminar-se através do tecido circundante é uma característica do câncer1. Em particular, a motilidade das células tumorais é uma característica dos tumores malignos, seja um tipo de tumor metastático, comoo câncer de mama2 ou colorretal3, ou um tipo localmente invasivo, como o gliomadifuso4,5.
Os exames de imagem têm um papel central na investigação de muitos aspectos dos fenótipos de células tumorais; No entanto, a imagem de células vivas é definitivamente prefer....
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa com seres humanos das instituições.
NOTA: Este estudo foi realizado utilizando o Incucyte S3 e/ou SX5 Live-Cell Analysis Instrument (referenciado como instrumento de análise de células vivas).
1. Geração de esferoides tumorais de tamanho reprodutível
NOTA: O protocolo (seção 1) descrito por Vinci et al., 2015 7,12, foi utilizado conforme relatado a seguir, com algumas modificações:
- Coletar as neuroesferas mutantes (NS) DMG H3K27M e ce....
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Resultados
O protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D para invasão e migração é resumido em um fluxo de trabalho simples e reprodutível na Figura 1. Ao semear as células DMG em placas de fundo redondo ULA 96 poços, NS de tamanho reprodutível são obtidos e usados nas etapas exibidas. Quando o SN atinge o tamanho ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 dias pós-semeadura), iniciam-se os ensaios de invasão12 e migração14 . A adição do complexo ALR/antic.......
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Discussão
A imunocitoquímica de células vivas 3D que adotamos aqui para invasão e migração de DMG pediátrica pode ser facilmente adaptada também para outros tipos de células tumorais altamente invasivas, incluindo linhagens de células de câncer de mama e cólon.
Diferentemente dos ensaios de imunocitoquímica de células vivas2D previamente realizados 10, quando se trabalha em 3D, sugere-se atentar para algumas etapas críticas. Em particular, para o ensaio de invasão que descrevemo.......
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Divulgações
Os autores não têm afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à Dra. Silvia Soddu e à Dra. Giulia Federici (Unidade de Redes Celulares e Alvos Terapêuticos Moleculares, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Roma, Itália) pelo acesso ao IncuCyte S3 Live Cell Imaging System na configuração preliminar do protocolo de imagem. Além disso, agradecemos a Bernadett Kolozsvari pela assessoria técnica. O estudo foi apoiado pela bolsa Children with Cancer UK (16-234) e pelo Ministério da Saúde italiano Ricerca Corrente. M Vinci é bolsista da Children with Cancer UK. R Ferretti recebeu a bolsa Fondazione Veronesi (2018 e 2019). Os autores agradecem à Fondazione Heal por seu apoio e à Children's Hospital Foun....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microplacas tratadas com TC de 96 poços | Corning | 3595 | tamanho 96 poços, placa de poliestireno, fundo plano |
| Accutase | Euroclone | Solução de ECB3056D | para dissociação da neuroesfera |
| de Burker | Mv câmara de | contagem | de células de FFL16034 |
| CD-44 (156-3C11) | Tecnologia de sinalização celular | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matriz Matrigel Corning | 356237 | Matriz de Membrana Basal (BMM), sem vermelho de fenol, sem LDEV | |
| Fabfluor-488 Corante de marcação | Incucyte | 4743 | Reagente de marcação de anticorpos (ALR): Anticorpo IgG2a 488 de camundongo para imunocitoquímica de células |
| vivas Incucyte S3 e/ou SX5 Instrumento de análise de células vivas | Sartorius | - | O instrumento Incucyte S3 e/ou SX5 é usado para monitoramento e vigilância celular em tempo real, saúde e viabilidade celular, migração e invasão, além de uma ampla gama de ensaios fenotípicos baseados em células. |
| Microscópio | invertido-qualquer | microscópio invertido | |
| Opti-Green Supressor de Fundo Reagente | Incucitário | 6500-0045 | Backgroung supressor reagente (BSR) |
| Tronco tumoral (TSM) médio | - | - | crescimento de células médias (veja referência no texto para detalhes) |
| Placa de Poço Múltiplo de Fixação Ultra-Baixa | Corning Costar | 7007 | tamanho 96 poço, fundo redondo claro |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A.
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Reimpressões e permissões
