Açık Kaynaklı Bir Laboratuvar Robotu Tarafından Otomatikleştirilmiş Av Tüfeği Proteomik Numune İşleme
Summary
Deterjan giderme, protein sindirimi ve peptit tuzdan arındırma adımlarını kapsayan kütle spektrometresi deneyleri için yarı otomatik protein numunesi hazırlamayı gerçekleştirmek üzere açık kaynaklı bir robotik sıvı taşıma sisteminin çalıştırılması için ayrıntılı protokol ve üç Python komut dosyası sağlanmıştır.
Abstract
Kütle spektrometresi bazlı av tüfeği proteomik deneyleri, enzymatic protein sindirimi ve temizleme dahil olmak üzere, önemli kişi-saat tezgah işçiliği alabilen ve toplu olarak değişkenlik kaynağı sunabilen birden fazla numune hazırlama adımı gerektirir. Pipetleme robotları ile laboratuvar otomasyonu manuel çalışmayı azaltabilir, verimi en üst düzeye çıkarır ve araştırma tekrarlanabilirliğini artırabilir. Yine de, standart otomasyon istasyonlarının dik başlangıç fiyatları, onları birçok akademik laboratuvar için uygun hale getiremez hale getirse de. Bu makalede, yarı otomatik protein azaltma, alkilasyon, sindirim ve temizleme adımlarını ayarlama talimatları da dahil olmak üzere uygun fiyatlı, açık kaynaklı bir otomasyon sistemi (Opentrons OT-2) kullanılarak bir proteomik örnek hazırlama iş akışı açıklanmaktadır; yanı sıra, OT-2 sistemini uygulama programlama arayüzü aracılığıyla programlamak için açık kaynaklı Python komut dosyalarına eşlik eder.
Introduction
Kütle spektrometresi bazlı av tüfeği proteomik, biyolojik numunelerdeki birçok proteinin bolluğunu aynı anda ölçmek için güçlü bir araçtır. Biyoinformatik analizi ile proteomik deneyler, biyobelirteçleri tanımlamak ve patolojik mekanizmaları destekleyen ilişkili biyolojik kompleksleri ve yolları keşfetmek için rutin olarak sunulur. Yüksek analit özgüllüğü ve potansiyel nicel doğruluğu ile av tüfeği proteomik, antikorlara güvenmeye gerek kalmadan klinik numune analizi için araştırma tesisleri ve tanı laboratuvarları tarafından benimsenmesi için mükemmel bir potansiyele sahiptir1,2.
Av tüfeği proteomik analizi için protein örnekleri hazırlamak için, biyolojik örneklerden (örneğin, hücreler ve dokular) çıkarılan proteinlerin tipik olarak, numune protein konsantrasyonunu, protein azaltmayı ve alkilasyonu ölçmek ve peptitlere enzimatik sindirim dahil olmak üzere uzun protokoller kullanılarak işlenmesi gerekir. Ayrıca, deterjan içeren yaygın lizis tamponlarında çıkarılan proteinler genellikle analizden önce ek tampon değişimi veya deterjan çıkarma adımları gerektirir, çünkü deterjan tripsin sindirimini engelleyebilir ve aşağı akış sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizinin performansını önemli ölçüde düşürebilir3. Peptitler tipik olarak enzymatic sindirimi takiben LC-MS/MS uyumlu çözücülerde daha fazla tuzdan arındırılır, kurutulur ve yeniden inşa edilir. Bu protein biyokimyası prosedürleri emek yoğun ve zaman alıcı olabilir. Böylece, proteomik iş akışlarının verimini sınırlamaya ve elde edilen verilerin değişkenliğine katkıda bulunmaya devam ederler4,5. İnsan hataları ve önyargıları, veri farkını ve tekrarlanabilirliğini etkileyen önemli faktörler olarak kabul edilmiştir6,7. Kütle spektrometresi numune hazırlama iş akışlarındaki insan hatalarını en aza indirmek için, otomatik pipetleme robotik sistemleri, av tüfeği proteomik ve hedefli kütle spektrometresi analizinden protein tanımlama ve nicelemenin verimini ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmek için kullanılmıştır, burada bu tür gelişmeler kritik araştırma ve klinik ortamlarda proteomik teknolojilerin yaygın olarak benimsenmesi için itici güç olarak kabul edilmiştir8, 9,10,11,12,13. Bununla birlikte, mevcut protokollerin çoğu, akademik ortamdaki veya sınırlı bir bütçeyle birçok laboratuvarda yardımcı programlarını sınırlayan, önemli yatırım ve eğitim gerektiren robotik sıvı işleme platformlarını kullanır.
Bu makalede, tipik bir av tüfeği proteomik numune hazırlama iş akışını yarı otomatikleştirmek için düşük maliyetli, açık kaynaklı robotik sıvı taşıma sistemi OT-2’yi kullanan bir protokol açıklanmaktadır. OT-2, diğer birçok robotik sıvı taşıma sisteminden daha düşük bir maliyete sahiptir ve yazma sırasında yaklaşık 5.000 ABD dolarına mal olur. Farklı modüllerin ve laboratuvar yazılımlarının fiyatlarını hesaba katırken, bu protokolde yazma sırasında deneyler kurmanın toplam maliyeti yaklaşık 10.000 $ ‘dır, bu da onu daha pahalı seçenekler üzerinde önemli ölçüde daha geniş bir laboratuvar kümesi için daha uygun hale getirir. OT-2, Python komut dosyaları aracılığıyla açık kaynaklı programlama ile uyumludur ve kullanıcı tanımlı DIY protokol tasarımında büyük esneklikler sunar. Şirket içinde geliştirilen üç komut dosyası kullanılarak, aşağıdaki protokoller, ot-2 istasyonunda tipik bir av tüfeği proteomik örnek hazırlama iş akışını arketipik bir protein standardıyla (sığır serum albümin; BSA) ve normal bir insan kalp lisatının karmaşık bir protein örneğidir (Şekil 1). (1) BSA örneği ve (2) karmaşık bir kardiyak lisat örneğinin işlenmesine ilişkin prosedürler sırasıyla Protokol 1, 2, 5, 6 ve 3, 4, 5, 6 bölümlerinde ayrıntılı olarak yer haline gelir. Sera-Mag karboksilat modifiye manyetik boncuklar, protein ve peptit numunelerindeki deterjanları ve tuzları çıkarmak için tek pot katı fazlı geliştirilmiş numune hazırlamada (SP3) kullanılır. Sığır serum albümin ve insan kalp proteinlerinden elde edilen triptik sindirimler SP3 boncukları tarafından daha fazla temizlenir ve LC-MS/MS analizi için gönderilir. Kütle spektrumları daha sonra peptit ve protein tanımlama için MaxQuant yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bizim tarafından gerçekleştirilen temsili sonuçlar, protokolün tezgah zaman tasarrufu sağlarken mükemmel teknik değişim katsayıları (CV) elde ettiğini ve el sindirmeden daha düşük olmadığını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol içinde kritik adımlar
En iyi performans için Opentrons onaylı labware, modüller ve OT-2 ile uyumlu sarf malzemeleri kullanılmalıdır. Opentrons’un Reference14’teki talimatını takiben özel laboratuvar yazılımları oluşturulabilir. OT-2 destesini, pipetleri ve labware’i ilk kez kullanıldığında kalibre ettiğinizden emin olun. Peptit ve protein temizliği için boncuk hazırlamak için SP3 boncuk üreticisinin yönergelerine uymak da önemlidir. Özellikl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen NIH ödülleri F32-HL149191’den YH’ye desteklendi; R00-HL144829’dan EL’e; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278’den MPL’ye. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 web tabanlı bir bilim illüstrasyon aracı yardımıyla oluşturulmuştur, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
Referências
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
