OPMERKING: Monsters die worden onderzocht met behulp van het iTACS-platform zijn cellen die zich hechten aan een zacht substraat. Het protocol voor het beoordelen van mechanische en chemische signalen is verdeeld in twee opeenvolgende delen: Acquisitie- en trainingsmodule (AcTrM) en Analyse- en visualisatiemodule (AnViM). 1. Acquisitie- en trainingsmodule (AcTrM) OPMERKING: AcTrM automatiseert het proces van gegevensverzameling en zelftraining van gebruikers. Bereid vóór elke gegevensverzameling een zacht substraat voor dat informatie kan verstrekken die nodig is om de krachten te kwantificeren die cellen erop uitoefenen. Hydrogel voorbereidingOPMERKING: Het doel hier is om een 1.250 Pa shear modulus, ongeveer 100 μm dikte, en 22 mm diameter polyacrylamide (PAA) hydrogel te bereiden. Bereid polyacrylamide-oplossing door de methode van Yeung et al. te volgen en giet de hydrogels volgens de stappen beschreven door Trepat et al.14,15. Een uitzondering op de procedure is dat de kralen direct onder de cellen een diameter van 0,5 μm hebben en gele fluorescentie uitzenden. Sla de stap over van het bevestigen van 2 μm-kralen aan het afdekglas als het kijkgebied naar verwachting een groot celvrij gebied heeft.OPMERKING: Hydrogel-voorbereidingsprotocol is nu redelijk vastgesteld in het veld16. In de daaropvolgende beschrijving worden de 0,5 μm kralen aangeduid als ‘bovenste kralen’, en de 2 μm kralen worden aangeduid als ‘onderste kralen’. De onderste kralen zijn echter optioneel wanneer het afgebeelde gebied een groot celvrij gebied bevat. Het bovenste kralenpatroon uit zo’n celvrij gebied zal het doel van het onderste kralenpatroon dienen. Monteer de hydrogel met ingebedde fluorescerende kralen op het microscoopstadium. Laat 15-20 minuten duren voordat de temperatuur van de plaat een steady-state bereikt.OPMERKING: Het bovenoppervlak van de plaat is gefunctionaliseerd met extracellulaire matrixeiwitten, maar de cellen zijn nog niet gezaaid op de hydrogel. Acquisitie van referentieafbeeldingen Deel 1: Een positielijst makenOPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het volgen van de AcTrM-aanwijzingen om locaties te kiezen met de beste kraalverdeling. In deze stap worden geen eerder gemaakte bestanden gebruikt. Belangrijke nieuwe mappen die in deze stap worden geproduceerd, zijn de mappen ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ en ‘textfiles’ en het geproduceerde bestand bevat het positielijstbestand. Zie figuur 2 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen voor het maken van een positielijst met AcTrM. Het gedemonstreerde voorbeeld verwerft gegevens bij 20x vergroting. Start μManager 2.0 – Beta. Voer AcTrM uit door op de knop AcTrM.bsh in het venster IMBL Resources te klikken. Selecteer in het venster met de titel Define Acquisition Properties de juiste doelstelling, tolerantie voor de nauwkeurigheid van lateraal positieherstel (d.w.z. XY), stapgrootte van de ruwe en verfijnde herfocussing (d.w.z. z) en waarde van een acceptabele beeldcorrelatiecoëfficiënt voor focusherstel.OPMERKING: Een fijnere tolerantie voor het laterale positieherstel zal het positieherstel vertragen, maar een aanzienlijke tolerantie vereist positiecorrectie tijdens gegevensanalyse en kan problemen veroorzaken bij focusherstel. Een kleinere stapgrootte zal de herfocussing vertragen, maar een zeer hoge stapgrootte kan snelle beweging veroorzaken met kansen om de focus te missen. Selecteer in het venster AcTrM – Stap 0 de optie Fresh Acquisition om een positielijst te maken.OPMERKING: Het venster met de titel AcTrM – Stap 1 bevat alle belangrijke volgende stappen. Deze stappen omvatten het verplaatsen van het podium, het aanpassen van de focus en het klikken op knoppen in de μManager. Deze stappen helpen bij het samenstellen van de lijst met posities die geschikt zijn voor gegevensverzameling. Klik op Live in Micromanager om de voorbeelden voor handmatige aanpassingen te visualiseren die worden vermeld in het actrm – stap 1 venster. Volg de stappen in dit venster. Verwerf nu het beeld van de kralen. Selecteer het juiste kanaal voor de bovenste kralen. Zorg ervoor dat je ook naar de onderste kralen kijkt. Selecteer hiervoor de kanalen voor de onderste kralen. Een wazig beeld van onderste kralen is te zien.OPMERKING: Kanalen kunnen worden geschakeld vanuit het vooraf ingestelde vervolgkeuzemenu in het hoofdvenster van μManager. Als de onderste kralen in het experiment worden gebruikt, zorg er dan voor dat ze op de geselecteerde positie aanwezig zijn. Deze kralen zien er wazig uit. Wanneer u de juiste positie selecteert, klikt u op Markeren in het venster Lijst met werkgebiedposities om de positie op te slaan.OPMERKING: De beste positie wordt bepaald door een dichte en uniforme verdeling van de bovenste kralen die direct onder het bovenoppervlak zijn ingebed (d.w.z. bovenste kralen) en ten minste twee kralen die aan het dekglas zijn bevestigd (d.w.z. onderste kralen) (aanvullende figuur S1). Focusherstel is sneller als de onderste kralen verschijnen als grote, onscherpe ringen. Als experimenten echter in één positie worden uitgevoerd zonder dat focus of lateraal positieherstel nodig is, negeert u instructies met betrekking tot de afbeelding van de onderste kralen. Volg de stappen 6-9 die worden beschreven in figuur 2 om extra posities in de lijst op te nemen.OPMERKING: Kies een paar extra posities zodat een eliminatieronde de beste posities op de plaat mogelijk kan maken. Deel 2: Verwerving van referentiebeeldenOPMERKING: Deze stap omvat geen handmatige invoer. Eerder gemaakte belangrijke bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer ‘textfiles/*.pos’. Belangrijke nieuwe bestanden en mappen die in deze stap worden geproduceerd, zijn die in de mappen ‘t0imgs’ en ‘tnimgs’. Zie figuur 3 en aanvullende figuur S2 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen die leiden tot het verkrijgen van referentiebeelden met behulp van AcTrM. Het venster AcTrM – Stap 2 bevat ook alle belangrijke stappen. Volg de stappen die worden vermeld in het venster AcTrM – Stap 2 en maak de keuzes in het venster Multidimensionale acquisitie . Als u bijvoorbeeld een lange tijdsverloop wilt uitvoeren, geeft u een aantal foto’s aan die moeten worden gemaakt, selecteert u het eerste kanaal als fasekanaal en selecteert u vervolgens het volgende kanaal voor de bovenste kralen en het kanaal daarna voor de onderste kralen. Klik op Sluiten in het venster Multidimensionale acquisitie en klik vervolgens op OK in het venster ActrM – Stap 2 . Kies in het venster AcTrM – Stap 3 ervoor om het op referentieafbeeldingen gebaseerde XYZ-positieherstel in te schakelen. De keuze is over het algemeen ja. Als beelden echter op één positie worden verkregen zonder ruimte voor focus of podiumdrift, is de keuze in het venster AcTrM – Stap 3 Nee. Stel in het venster AcTrM – XYZ Recovery Options het kanaal in voor ruw XYZ-herstel, of verfijnd XYZ-herstel, regio en kanaal moeten worden uitgevoerd voor verfijnd XYZ-herstel en de richting waarin moet worden begonnen met opnieuw scherpstellen (aanvullende figuur S4). Na voltooiing zal AcTrM referentiebeelden verkrijgen.OPMERKING: Typische keuzes voor het kanaal zijn het onderste kralenkanaal. XYZ-herstel werkt het beste wanneer het wordt uitgevoerd met het volledige beeld in de huidige implementatie. Referentiebeelden bevatten meestal een doorgelaten lichtbeeld van de hydrogel, een fluorescerend beeld van de bovenste kralen en een fluorescerend beeld van de onderste kralen. De inhoud van elke afbeeldingenset kan variëren op basis van de keuzes die zijn gemaakt in het venster Multidimensionale acquisitie . Toch krijgt de software het referentiebeeld dat is ingesteld op elke positie die is bepaald in figuur 2. Aan het einde van deze stap worden drie mappen gemaakt in de gekozen map: ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ en ‘textfiles’. De map ‘t0imgs’ bevat referentieafbeeldingen in het formaat dat door μManager wordt herkend en in volgende stappen wordt gebruikt; De map ‘tnimgs’ bevat afzonderlijke TIFF-afbeeldingen met bestandsnamen ‘c0_p0_t0.tif’, ‘c1_p0_t0.tif’, enz. Hier staat ‘c’ voor het kanaal, ‘p’ staat voor de positie en ‘t’ staat voor de tijd. Na deze letters volgen respectievelijk het kanaalnummer, positienummer en framenummer. De map ‘textfiles’ bevat de positielijst in XML-formaat en gebruikerskeuzes voor beeldacquisitie en positieherstel. Cel zaaien en groeiOPMERKING: Het iTACS-platform heeft de flexibiliteit om monstervoorbereidingsprotocollen te accommoderen die worden gebruikt bij gemeenschappelijke in vitro beoordeling van mechanisch gedrag van adherente cellen, waaronder schaarse cellen, volledig confluente monolaag, netwerkvormingstest en monolagen met gaten of significante hiaten. Kweek pulmonale microvasculaire endotheelcellen van ratten tot samenvloeiing in een kolf17,18. Maak de cellen los met behulp van trypsine. Resuspend de cellen in een kweekmedium met 10% foetaal runderserum tot een concentratie van 1 x 106 cellen/ml. Plaats een druppel van 5 μL van de geresuspendeerde cellen op een gedeeltelijk droog hydrogeloppervlak en plaats deze in de celkweekincubator.OPMERKING: Na 2 dagen in het kweekmedium dat 10% foetaal runderserum bevat, vormen de cellen in die druppel een overvol eiland van cellen1. Geautomatiseerde beeldacquisitie voor het resterende experimentOPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het volgen van de AcTrM-aanwijzingen om de afbeeldingsacquisitie te hervatten. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die door deze stap worden gebruikt, zijn ‘textfiles/*.pos’ en onderste kraalafbeeldingsbestanden in de map ‘t0imgs’. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden geproduceerd, zijn bijgewerkte positielijstbestanden en afbeeldingen ‘tnimgs / * _t * .tif’. Zorg ervoor dat het microscoop-omgevingscontrolesysteem stabiele weefselkweekomstandigheden bereikt. Monteer de plaat met gekweekte cellen voorzichtig op het microscoopstadium. Laat 15-20 minuten intrekken om de temperatuur en vochtigheid te stabiliseren.OPMERKING: Zie figuur 4 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen die leiden tot het verkrijgen van afbeeldingen voor het resterende experiment met AcTrM. Start μManager 2.0 – Beta. Voer AcTrM uit door op de knop AcTrM.bsh in het venster IMBL Resources te klikken.OPMERKING: Negeer de keuzes die zijn gemaakt in het venster Acquisitie-eigenschappen definiëren , maar gebruik de keuzes die in de vorige stap zijn gemaakt. Selecteer in het venster AcTrM – Stap 0 doorgaan met gepauzeerde acquisitie. Selecteer de vergroting en map die zijn geïdentificeerd in het venster Multidimensionale acquisitie in de eerdere stap waarin gegevensmappen (‘t0imags’, ‘tnimgs’ en ‘tekstbestanden’) zijn opgeslagen.OPMERKING: De titel van het venster begeleidt de gebruiker bij het kiezen van de juiste map. Selecteer in het venster De plaat verplaatsen de opties voor het verplaatsen van de plaat (drie niet-lineaire posities) samen met het kanaal dat wordt gebruikt voor de herpositionering.OPMERKING: Opgeslagen beelden worden in de camera weergegeven. Als overlappende afbeeldingen worden weergegeven als een rode, groene en zwarte kleurenafbeelding, voert u handmatige aanpassingen uit. Klik op Accepteren om door te gaan met de overname.OPMERKING: Deze stap overwint de kleine verschuivingen van de onherleidbaarheid van plaatuitlijning wanneer de plaat opnieuw op het microscooppodium wordt gemonteerd. Volg de AcTrM-aanwijzingen om de uitlijning op elk van de drie posities te versnellen door een samengestelde afbeelding weer te geven van de referentieafbeelding die in het rood wordt weergegeven (meestal van de onderste kralen) en de afbeelding die momenteel wordt waargenomen door het doel dat in het groen wordt weergegeven. Door het groen voldoende dicht bij rood te krijgen, blijft er minder werk voor de software. Wanneer de overlap perfect is, ziet de samengestelde afbeelding er geel en zwart uit. Voldoende dichtbij is meestal wanneer dezelfde onderste kralen zichtbaar zijn in zowel rode als groene afbeeldingen, en de overeenkomstige rode en groene onscherpe ringen elkaar raken. Nadat de herpositionering van de plaat is voltooid, brengt AcTrM het podium naar elke geselecteerde positie en herstelt de XYZ-positie door het referentiebeeld af te stemmen op wat momenteel door de camera wordt gezien. De eerste laterale (XY) positie wordt gematcht en vervolgens wordt de focus (Z) gematcht. Ruw herstel wordt gevolgd door verfijnd herstel van de positie en focus. Updates van de huidige status van het experiment worden op het scherm weergegeven via een vierdelig venster dat wordt weergegeven in aanvullende figuur S3. De verkregen beelden worden opgeslagen in de map ‘tnimgs’ na ‘*_t1.tif’, ‘*_t2.tif’, waarmee het aantal tijdswaarden voor de afbeeldingenset wordt aangegeven. Als XYZ-herstel een bijgewerkte positie identificeert, wordt de nieuwe positielijst gegenereerd en opgeslagen in de map ‘tekstbestanden’. 2. Analyse en Visualisatie Module (AnViM) Geautomatiseerde data-analyse instellenOPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de locatie van de map ‘tnimgs’. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn ‘tnimgs /* .tif’. Belangrijke nieuwe bestanden en mappen die in deze stap worden geproduceerd, zijn de map ‘analyse’ in dezelfde bovenliggende map als ‘tnimgs’ en mappen voor elke positie ‘analyse/p*’. Binnen elke ‘analyse/p*’ maakt deze stap een nieuwe ‘*.tif’ afbeeldingsbestanden aan in de mappen ‘phs’ en ‘tny’. Deze afbeeldingen zijn bijgesneden en gede-drifted afbeeldingen van cellen en bovenste kralen. De andere gecreëerde bestanden zijn ‘analysis/analysisChoices.txt’ met analysekeuzes, ‘analysis/p*/skipAnalysis.txt’, waarin gevallen worden vermeld waarin analyse wordt overgeslagen vanwege significante reeds bestaande drift, en ‘analysis/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat’ waarin geschatte driftwaarden worden vermeld. AnViM wijzigt de onbewerkte gegevens in de map ‘tnimgs’ niet. Zie figuur 5 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen die leiden tot het instellen van geautomatiseerde gegevensanalyse met behulp van AnViM. Start de Fiji-software en selecteer de eerste optie in het vervolgkeuzemenu MSM met het label MSM – voorbewerking. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de map met de map ‘tnimgs’, die de geanalyseerde gegevens bevat. Definieer het kanaal voor de afbeeldingen. Volg de richtlijnen van aanvullende figuur S5 en identificeer de kanaalnummers van het doorgelaten lichtbeeld van de cellen (fasecontrastbeeld van de cellen), onderste kralenafbeelding en bovenste kralenafbeelding. De volgende drie selectievakjes (‘Bestanden naar de positiemap verplaatsen’, ‘Extra correctie uitvoeren voor starre bewegingen’ en ‘Gegevens bijsnijden en opslaan in positiemap’) zijn meestal aangevinkt. Definieer ten slotte de tolerantie voor het afwijzen van sterk afgedreven gegevens, pixelgrootte en zijden van de afbeelding waar de cellen elkaar kruisen. Reageer op de prompt om de helderheid en het contrast van de onderste kraalafbeeldingen te verbeteren, zodat de kralen prominent worden weergegeven. Pas dit aan met behulp van de schuifbalk in het menu en klik op OK. Voer nu positiecorrectie uit om van de eventuele verschuivingen af te komen. Als u klaar bent, wordt een analysemap gemaakt.OPMERKING: Contrastverbetering is meestal niet nodig, maar deze voorziening is beschikbaar voor experimenten waarbij de blootstelling aan lasers moet worden geminimaliseerd. Na die keuze kopieert AnViM de bestanden van de map ‘tnimgs’ naar de map ‘analyse’. De bestanden die overeenkomen met elke positie worden opgeslagen in mappen ‘analyse/p0, analyse/p1’, enz. Binnen elk van deze positiemappen maakt AnViM ‘cels’, ‘defs’ en ‘refs’-mappen met respectievelijk de originele doorgelaten lichtafbeelding, afbeeldingen van bovenste kralen en afbeeldingen van onderste kralen (aanvullende figuur S6). AnViM analyseert vervolgens de starre beweging in de afbeeldingen van de onderste kralen en creëert een ‘phs’-map met een gecorrigeerd doorgelaten lichtbeeld van de cellen en een ‘tny’-map met bijgewerkte bovenste kralenafbeeldingen. Ten slotte worden gebruikerskeuzes van de kanalen, bewerkingen, tolerantie, pixelgrootte en grensoverschrijding opgeslagen in het bestand ‘analysisChoices.txt’ (aanvullende figuur S6). Kwantificering van vervorming van hydrogel en monolaagOPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat kwantificering van beweging uit een reeks afbeeldingen een snel evoluerend veld is19. De technologie wordt voortdurend geoptimaliseerd voor functies, waaronder snelheid, nauwkeurigheid, specifieke functies in de onbewerkte afbeeldingen en specifieke vervormingspatronen. Daarom is het waarschijnlijk dat sommige gebruikers een andere deformatiekwantificeringsbenadering gebruiken dan degene die hier wordt gepresenteerd. Deel 1: Kwantificering van hydrogelvervormingOPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en de selectie van de rasterresolutie. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer ‘p*/tny/*.tif’. Belangrijke nieuwe bestanden die hierin worden geproduceerd, zijn onder meer ‘p*/displacement/*_disp.dat’ dat verplaatsingsvectoren van het bovenste oppervlak van de hydrogel opsomt. Zie figuur 6 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om via AnViM de Particle Image Velocimetry-analyse op de bovenste kralenafbeeldingen in te schakelen20. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM – Gel Deformation. Selecteer hier de optie die geschikt is voor het experiment. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de bovenliggende map van de map ‘analyse’ met de geanalyseerde gegevens. Selecteer in het venster Parameters voor het berekenen van gelvervorming de juiste kruiscorrelatievenstergrootte, geluidsniveau en drempelwaarde (aanvullende figuur S7)20.OPMERKING: De resultaten worden opgeslagen in een nieuw aangemaakte ‘verplaatsingsmap’ binnen elke positiemap ‘analyse/p0, analyse/p1’, enz. Hier worden alle uitvoerbestanden opgeslagen. Deel 2: Kwantificering van monolaagvervormingOPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en de selectie van de rasterresolutie. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer ‘p*/tny/*.tif’. Belangrijke nieuwe bestanden die hierin worden geproduceerd, zijn onder meer ‘p*/velocity/*_vel.dat’ dat bewegingsvectoren van de cellen weergeeft. Zie figuur 7 voor de visuele beschrijving van de stappen om via AnViM de Particle Image Velocimetry-analyse op de bovenste kralenafbeeldingen in te schakelen20. De procedure is vergelijkbaar met de procedure die wordt gevolgd voor het kwantificeren van hydrogelvervorming en selecteert MSM – Cellular Motion in het vervolgkeuzemenu MSM . De resultaten worden opgeslagen in een nieuw aangemaakte ‘velocity’ directory binnen elke positiemap ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc. Kwantificering van cel-ECM en cel-celkrachtenOPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap, het aangeven van de hydrogelstijfheid en het reageren op cellulaire clustersegmentatieprompts om cellen uit het niet-celgebied te detecteren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer ‘p*/displacement/*_disp.dat’. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden geproduceerd, zijn onder meer: ‘p*/traction/*_trac.dat’, waarin de krachten worden vermeld die door de cellen op de hydrogel worden uitgeoefend; “p*/traction/*_domain.dat”, waarin de locatie van rasterpunten die cellen bevatten, wordt vermeld; en voer bestanden ‘p*/traction.in, p*/clusterInput.txt’ en ‘p*/prestress.in’ in in die gebruikerskeuzes voor deze stap vastleggen. Na de eerste kwantitatieve beoordeling van cel-ECM en cel-celkrachten zijn verschillende variaties op de techniek ontwikkeld1,15. De variaties richten zich op specifieke gevallen van substraten, cellen, experimentele omstandigheden of numerieke hulpmiddelen7,8,21,22. Zie figuur 8 voor de visuele beschrijving die via AnViM, de Fourier Transform Traction Microscopy en Monolayer Stress Microscopy analyse van de hydrogel deformatiegegevens1,2,15 in werking treedt. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM – Cell-ECM en Cell-Cell Forces (derde optie in het vervolgkeuzemenu). Selecteer in het dialoogvenster bestandsbrowser de bovenliggende map van de map ‘analyse’ met de mappen ‘tnimgs’ en ‘analyse’ met geanalyseerde gegevens. Klik op Selecteren. Voer in het venster Parameters voor het berekenen van cellulaire krachten de schuifmodulus, de dikte van de hydrogel en het verwachte geluidsniveau in. Selecteer OK. Hierdoor kan het tractie uitvoeren via de MATLAB-functie.OPMERKING: Na deze ingangen berekent AnViM cel-ECM-krachten. Geef daarna aan of de monolaag confluent is. Als het hele celbeeld bedekt is met cellen, is het antwoord Ja. In dat geval worden de cel-celkrachten over het hele frame berekend. Aan de andere kant, als een deel van de afbeelding geen cellen heeft, is het antwoord Nee. Volg in dat geval de AnViM-aanwijzingen om segmentatie van het afbeeldingsgebied dat cellen bevat, te vergemakkelijken. Als het antwoord nee is, tekent u handmatig een veelhoek rond het niet-celobject wanneer de software daarom vraagt en selecteert u vervolgens een geschikte methode(n) voor segmentatie. De software vraagt om de kleur (zwart of wit) van de cellen. Vink de optie Fill Spots Automatically in de software aan en klik op OK.OPMERKING: De stappen voor het segmenteren van een niet-confluente monolaag worden behandeld in het eerste deel van ‘Punt 2.4. Cel-ECM-krachten worden opgeslagen in ‘*_trac.dat’-bestanden in een nieuw aangemaakte map ‘traction’ binnen elke positiemap, en de invoer in de cel-ECM-krachtberekeningssoftware wordt opgeslagen in het bestand ‘traction.in’ (aanvullende figuur S8). Cel-celkrachten worden opgeslagen in ‘*_prestress.dat’-bestanden in een nieuw aangemaakte map ‘prestress’ binnen elke positiemap, en de invoer in de cel-celkrachtberekeningssoftware wordt opgeslagen in het bestand ‘prestress.in’ (aanvullende figuur S9). Rasterpuntwaarden toewijzen aan afzonderlijke cellenOPMERKING: Een van de huidige aandachtspunten van iTACS is het introduceren van een eenvoudige benadering om de gemeten mechanische signalen in het veld te interpreteren. Deze aanpak is gunstig voor het onderzoeken van mechanische interacties tussen naburige cellen van een cluster18. Over het algemeen bevinden de tot nu toe gekwantificeerde eigenschappen zich op regelmatig verdeelde rasterpunten over het cellulaire cluster. Deze gegevens identificeren de mediane, gemiddelde en standaarddeviatie van geselecteerde eigenschappen binnen de morfologische grens van individuele cellen en wijzen die toe als cellulaire fysieke eigenschappen / signalen. Hieruit wordt de standaarddeviatie gebruikt om variabiliteit aan te geven, het verschil tussen gemiddelde en mediaan wordt gebruikt om de aard van de verdeling aan te geven en de mediaanwaarde wordt gebruikt om de algehele toestand van de cellen voor de geselecteerde eigenschappen aan te geven.Deel 1: Segmentatie van het afbeeldingsgebied dat cellen bevatOPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van gegevensmap en het reageren op de segmentatieprompts om cellen uit het gebied zonder cel te detecteren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn onder meer ‘p*/phs/*.tif’. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden geproduceerd, zijn ‘p*/phs/bwImages/*.tif’, binaire afbeeldingen die celgebieden scheiden van gebieden zonder cel, ‘p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt’, waarin het percentage afbeeldingsgebied wordt vermeld dat in elke instantie door cellen wordt bedekt, en ‘p*/clusterInput.txt’, waarin gebruikerskeuzes worden vastgelegd die zijn ingevoerd in de AcTrM-interface. Zie Afbeelding 9 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om het afbeeldingsgebied dat cellen bevat te segmenteren. Dit deel moet worden voltooid voordat de cel-celkrachten worden berekend. In dat geval hoeven deze stappen niet te worden herhaald. Ook als deze stappen worden uitgevoerd vóór de cel-celkrachtberekeningen, worden ze niet gevraagd aan het begin van de krachtberekeningen. Start de Fiji-software en selecteer segmentatie – cellulair cluster in het vervolgkeuzemenu MSM. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’, enz., die eigenschappen bevat die zijn gekwantificeerd op regelmatig verdeelde rasterpunten. Geef aan of de monolaag confluent is.OPMERKING: De onderstaande stappen worden alleen aangeroepen als de monolaag niet samenvloeit. Volg de AnViM-aanwijzingen om de nieuwe meerledige benadering toe te passen om de afbeeldingsgebieden te identificeren die cellen bevatten. Het proces omvat vier methoden – elk benadert segmentatie op een andere manier. Een of meerdere van deze methoden die in combinatie worden gebruikt, bestrijken een breed scala aan afbeeldingen van de cellen. Probeer daarom verschillende benaderingen om erachter te komen welke combinatie het beste werkt voor hun gegevens. Pas de ‘Domain connection factor’ en ‘Smear factor’ aan om optimale segmentatie te verkrijgen.OPMERKING: De ‘Uitstrijkfactor’ maakt de gebieden die cellen bevatten groter. Geef aan of de cellen zwart of wit worden weergegeven in de binaire afbeelding. Kies in het venster Routebeschrijving om de grensafbeelding op te schonen of u de afbeelding automatisch of handmatig wilt opschonen.OPMERKING: Ongewenste kenmerken van de afbeeldingen zijn zwarte vlekken op de pixels bezet door cellen en witte vlekken op de pixels die zijn losgekoppeld van het te analyseren celcluster. Analyse kan alleen worden gedaan op de regio’s die zijn aangesloten. Dus meerdere losgekoppelde regio’s moeten afzonderlijk worden geanalyseerd. Deel 2: Segmentatie van de individuele cellen in de afbeeldingenOPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het reageren op de segmentatieprompts om individuele cellen in de afbeelding te detecteren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn ‘p*/phs/*.tif’ en ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Belangrijke nieuwe geproduceerde bestanden zijn onder meer ‘p*/phs/textResults/*.csv’, die cellulaire morfologische eigenschappen bevatten. Zie figuur 10 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om individuele cellen van de monolaag te segmenteren. Start de Fiji-software en selecteer segmentatie – afzonderlijke cellen in het vervolgkeuzemenu MSM. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’, enz., die eigenschappen bevat die zijn gekwantificeerd op regelmatig verdeelde rasterpunten. Geef in het venster Kies de invoerparameters de maximale beeldverhouding, de prominentie van hoeveel het celcentrum opvalt ten opzichte van de celgrens en twee vervagende parameters om de detectie van de cellen te begeleiden (aanvullende figuur S10). Teken op de afbeeldingsstapel voor elke positie een veelhoek op de kleinste normale cel. Dit wordt gebruikt om het gebied te berekenen. Alles wat kleiner is dan dit, wordt door de software niet als een cel beschouwd. Teken vervolgens een veelhoek rond de grootste normale cel en geef aan of het celcentrum of de cel-celinterface helderder is.OPMERKING: AnViM maakt vervolgens bestanden ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ , enz., Voor elk frame met informatie over cellen binnen dat frame. In dit stadium bevat dit bestand morfologische informatie over de cellen, waaronder gebied, centroïde, omtrek, oriëntatie, circulariteit, beeldverhouding, afgerondheid, soliditeit, afstand tot het niet-celgebied. De lengte-eenheid in deze eigenschappen is pixels en de hoek is in graden. Ten slotte wordt dit bestand bijgewerkt om cellulaire pixelintensiteit, beweging en krachten in de volgende stappen te bevatten. Deel 3: In kaart brengen van de pixelintensiteiten op de cellenOPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toewijzingseigenschappen en parameters. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn ‘p*/phs/*.tif’ (of ‘p*/fluo/*.tif ‘) en ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden geproduceerd, zijn ‘p*/phs/textResults/*.csv’, waarin cellulaire morfologische eigenschappen worden vermeld. Zie figuur 11 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om de pixelintensiteiten in het gebied van individuele cellen en hun aangrenzende gebied te beoordelen en te definiëren als eigenschappen van de cellen. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM de optie Kaart op cellen – Intensiteiten. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’, enz., die eigenschappen bevat die zijn gekwantificeerd op regelmatig verdeelde rasterpunten. Selecteer Celdeling detecteren of Cellulaire fluorescentie kwantificeren wanneer de software daarom vraagt. Definieer de grootte van de aangrenzende regio. Schakel de selectievakjes Eigenschappen van het aangrenzende gebied verzamelen en Eigenschappen van cellen verzamelen in. Klik op OK. Geef in het venster Doel van het opnemen van de cellulaire intensiteit aan welk type afbeelding moet worden gebruikt voor intensiteitstoewijzing, de grootte van het aangrenzende gebied en of er gegevens worden verzameld voor individuele cellen of beide cellen en hun aangrenzende regio’s (aanvullende figuur S11).OPMERKING: Het in kaart brengen van de pixelintensiteiten van een fasecontrastbeeld maakt het mogelijk om celdelingsgebeurtenissen te detecteren. Het in kaart brengen van fluorescerende beeldintensiteiten zal het mogelijk maken om fluctuaties in de fluorescerend gelabelde cytoplasmatische moleculen te detecteren. De uitvoer van de bovenstaande stappen is de gemiddelde, mediane, standaarddeviatie, minimale en maximale pixelintensiteitswaarden voor individuele cellen. Deze nummers worden als nieuwe kolommen ingevoerd in de bestanden “phs/textResults/0001.csv”, “phs/textResults/0002.csv” , enz. Deel 4: In kaart brengen van de krachten en beweging op de cellenOPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toewijzingseigenschappen en parameters. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn ‘p*/phs/textResults/*.csv’, ‘p*/velocity/*_vel.dat’, ‘p*/displacement/*_disp.dat’, ‘p*/traction/*_trac.dat’, ‘p*/prestress/*_prestress.dat’ en ‘p*/phs/bwImages/*.tif ‘. Tijdens deze stap worden geen nieuwe bestanden gemaakt. In plaats daarvan wordt de nieuwe informatie (cellulaire kracht en bewegingseigenschappen) toegevoegd aan de bestanden ‘p*/phs/textResults/*.csv ‘. Zie figuur 12 voor de visuele beschrijving van de stappen om de krachten en beweging in het gebied van individuele cellen en hun aangrenzende gebied te beoordelen en te definiëren als eigenschappen van de cellen. Kies uit het MSM-vervolgkeuzemenu Kaart op cellen – Bewegings-/krachtgegevens (aanvullende figuur S12). Volg vervolgens de stappen in stap 2.4.3.OPMERKING: Nieuwe kolommen worden toegevoegd aan de bestanden ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’, enz. en omvatten de gemiddelde, mediane en standaardafwijking van snelheid, de oriëntatie van snelheid, gemiddelde cytoskeletspanning, spanningsanisotropie, spanningsenergie in de hydrogel, de oriëntatie van de hoogste spanning en de grootte van cel-ECM-tractie (aanvullende figuur S13). Visualisatie van resultaten Deel 1: Het volgen van de cellulaire identiteiten in het experimentOPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toegewezen eigenschappen om te visualiseren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn ‘p*/phs/textResults/*.csv’. Belangrijke nieuwe bestanden die tijdens deze stap worden geproduceerd, zijn onder meer ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’, dat een tijdsspoor van de mobiele data bevat. Zie figuur 13 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om de eigenschappen van individuele cellen gedurende de gehele duur van het experiment te volgen. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM de optie Resultaten – Gegevens bijhouden. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’, enz., met cellulaire eigenschappen die moeten worden bijgehouden. Als u klaar bent, klikt u op Selecteren. Kies in het venster Startpunt kiezen voor traceren het startframe voor bewaking en het aantal frames dat tegelijkertijd wordt bijgehouden (aanvullende afbeelding S14). Begin altijd vanaf framenummer 2, omdat de snelheid niet kan worden bepaald voor framenummer 1. Als u klaar bent, klikt u op OK. Kies in het venster De variabelen controleren om tracks te maken door de namen van de variabelen te typen of door de termen in de selectievakjes te selecteren (Aanvullende afbeelding S15). Klik vervolgens op OK.OPMERKING: Tracking genereert ‘phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’-bestanden waarbij elke kolom een uniek celnummer bevat en elke opeenvolgende rij de opeenvolgende tijdinstantie vertegenwoordigt. Deel 2: Generatie van tijdsporen van de beoordeelde cellulaire eigenschappenOPMERKING: Handmatige invoer voor deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toegewezen eigenschappen om te visualiseren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. Belangrijke nieuwe bestanden die tijdens deze stap worden geproduceerd, zijn ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.tif’, die tijdspoorplots bevatten en ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.csv’, die plotgegevens bevatten. Zie figuur 14 voor de visuele beschrijving van de volgende stappen om tijdsporen van de beoordeelde cellulaire eigenschappen te genereren. Start de Fiji-software en selecteer in het vervolgkeuzemenu MSM de optie Resultaten – plot. Selecteer in het dialoogvenster van de bestandsbrowser de positiemap ‘analyse/p0’, ‘analyse/p1’, enz., met bijgehouden cellulaire eigenschappen die moeten worden uitgezet. Kies of u het plotten wilt beperken tot cellen met ononderbroken tracks door op de knop Ja of Nee te klikken.OPMERKING: Met deze optie worden de cellen genegeerd, die in een of meer tijdsgevallen niet konden worden gedetecteerd. Kies het aantal variabelen dat tegelijkertijd moet worden uitgezet en klik op OK.OPMERKING: Momenteel staat AnViM toe dat maximaal drie variabelen in dezelfde plot worden weergegeven. Kies afzonderlijke variabelen voor het plotten met behulp van een vervolgkeuzemenu.OPMERKING: Met deze stappen maakt u een TIFF-bestand (Tagged Image File Format) en een door komma’s gescheiden gegevensbestand in de map ‘phs/trackedDataPlots/’. De bestandsnaam bestaat uit variabelenamen gescheiden door een onderstrepingsteken en eindigt met een celnummer. Deel 3: Genereren van heatmaps van de beoordeelde cellulaire eigenschappenOPMERKING: Handmatige invoer in deze stap omvat het identificeren van de gegevensmap en het selecteren van toegewezen eigenschappen om te visualiseren. Belangrijke eerder gemaakte bestanden die in deze stap worden gebruikt, zijn ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. Belangrijke nieuwe bestanden die in deze stap worden gegenereerd, zijn ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’, de heatmaps van cellulaire eigenschappen. Zie figuur 15 voor de visuele beschrijving van de stappen om heatmaps van de beoordeelde cellulaire eigenschappen te genereren. Kies uit het msm-vervolgkeuzemenu Resultaten – Afbeelding. Volg de stappen die worden beschreven in stap 2.5.2.OPMERKING: De uitvoer wordt opgeslagen als TIFF-bestand bestanden in de map ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’. De bestandsnamen zijn het tijdinstantienummer en de naam van de variabele, gescheiden door een onderstrepingsteken.