توليد ذاتية التجميع الأعضاء القلب البشري المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات
Summary
هنا، نقوم بوصف بروتوكول لإنشاء أجهزة القلب البشرية ذات الصلة بالتنمية (hHOs) بكفاءة باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عن طريق التنظيم الذاتي. يعتمد البروتوكول على التنشيط التسلسلي للإشارات التنموية وينتج أنسجة قلب بشرية معقدة للغاية ووثيقة الصلة وظيفيا.
Abstract
القدرة على دراسة تطور القلب البشري في الصحة والمرض محدودة للغاية من خلال القدرة على نمذجة تعقيد القلب البشري في المختبر. إن تطوير منصات أكثر كفاءة تشبه الأعضاء يمكنها نمذجة المجمع في الأنماط الظاهرية في الجسم الحي ، مثل الأعضاء العضوية والأعضاء على الشريحة ، سيعزز القدرة على دراسة نمو القلب البشري والمرض. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتوليد أعضاء القلب البشرية المعقدة للغاية (hHOs) من خلال التنظيم الذاتي باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وتنشيط المسار التنموي التدريجي باستخدام مثبطات الجزيء الصغيرة. يتم إنشاء الأجسام الجنينية (EBs) في لوحة من 96 بئرا مع آبار مرفق مستديرة القاع ومنخفضة للغاية ، مما يسهل ثقافة التعليق للهياكل الفردية.
تخضع EBs للتمايز إلى hHOs من خلال استراتيجية تعديل إشارات Wnt من ثلاث خطوات ، والتي تنطوي على تنشيط مسار Wnt الأولي للحث على مصير mesoderm القلبي ، وخطوة ثانية من تثبيط Wnt لإنشاء أنساب قلبية نهائية ، وخطوة تنشيط Wnt ثالثة للحث على أنسجة الأعضاء البروبيكاردية. هذه الخطوات، التي نفذت في شكل 96 بئرا، هي ذات كفاءة عالية، استنساخها، وتنتج كميات كبيرة من organoids لكل شوط. يكشف التحليل عن طريق التصوير المناعي من اليوم الثالث إلى اليوم الحادي عشر من التمايز عن مواصفات حقل القلب الأول والثاني والأنسجة المعقدة للغاية داخل hHOs في اليوم 15 ، بما في ذلك أنسجة عضلة القلب مع مناطق خلايا القلب الأذينية والبطينية ، وكذلك الغرف الداخلية المبطنة بالأنسجة القلبية. كما تظهر الأجهزة العضوية شبكة الأوعية الدموية المعقدة في جميع أنحاء الهيكل وبطانة خارجية من الأنسجة epicardial. من وجهة نظر وظيفية، فاز hHOs بقوة والحاضر نشاط الكالسيوم العادي كما يحددها التصوير الحي فلو-4. بشكل عام، يشكل هذا البروتوكول منصة صلبة للدراسات المختبرية في الأنسجة القلبية الشبيهة بالأعضاء البشرية.
Introduction
عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي النوع الأكثر شيوعا من العيوب الخلقية في البشر وتؤثر على ما يقرب من 1٪ من جميع المواليد الأحياء1،2،3. وفي معظم الظروف، لا تزال أسباب ال CHDs غير معروفة. تشكل القدرة على إنشاء نماذج قلب الإنسان في المختبر التي تشبه إلى حد كبير القلب البشري النامي خطوة هامة إلى الأمام لدراسة الأسباب الكامنة وراء ال CHDs مباشرة في البشر بدلا من النماذج الحيوانية البديلة.
مثال نماذج الأنسجة المزروعة في المختبر هي organoids ، 3D يبني الخلية التي تشبه الجهاز من مصلحة في تكوين الخلايا والوظيفة الفسيولوجية. غالبا ما تستمد الأجهزة العضوية من الخلايا الجذعية أو خلايا السلف وقد استخدمت بنجاح لنمذجة العديد من الأعضاء مثل الدماغ4,5, الكلى6,7, الأمعاء8,9, lung10,11, liver12,13, والبنكرياس14,15 ، على سبيل المثال لا الحصر. وقد ظهرت دراسات حديثة تثبت جدوى إنشاء أجهزة القلب ذاتية التجميع لدراسة نمو القلب في المختبر. وتشمل هذه النماذج استخدام الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) لنموذج التنمية في وقت مبكر القلب16,17 تصل إلى مواصفات الأذين البطين18 والخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) لتوليد طبقة متعددة الجراثيم القلبية endoderm organoids19 وcededs20 غرف مع تكوين الخلوية معقدة للغاية.
تقدم هذه الورقة بروتوكول تعديل WNT ثلاثي الخطوات الجديد لتوليد hHOs معقدة للغاية بطريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة. يتم إنشاء الأجهزة العضوية في لوحات 96 بئرا ، مما يؤدي إلى نظام قابل للتطوير وعالي الإنتاجية يمكن أن يكون آليا بسهولة. تعتمد هذه الطريقة على إنشاء مجاميع hPSC وتفعيل الخطوات التنموية لتولد القلب ، بما في ذلك تكوين ميسودرم والفطرية القلبية ، ومواصفات مجال القلب الأولى والثانية ، وتشكيل الجهاز البروباديري ، ومواصفات الأذين البطين. بعد 15 يوما من التمايز، تحتوي hHOs على جميع أنساب الخلايا الرئيسية الموجودة في القلب، والغرف الداخلية المحددة جيدا، والغرف الأذينية والبطينية، وشبكة الأوعية الدموية في جميع أنحاء الجهاز. هذا النظام العضوي القلب متطورة للغاية وقابلة للاستنساخ قابلة للتحقيق في التحليلات الهيكلية والوظيفية والجزيئية، والنسخ في دراسة تطور القلب، والأمراض، والفحص الدوائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت التطورات الأخيرة في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية وغيرها من الخلايا ذات الأصل القلبي لنمذجة نمو القلب البشري22,24,25 والمرض26,27,28 وكأدوات لفحص العلاج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز K01HL135464 و R01HL151505 وجمعية القلب الأمريكية تحت رقم الجائزة 19IPLOI34660342. نود أن نشكر MSU المتقدمة المجهر الأساسية والدكتور وليام جاكسون في قسم MSU لعلم الصيدلة وعلم السموم للوصول إلى المجاهر confocal، وIQ المجهر الأساسية، وMSU الجينوم الأساسية لخدمات التسلسل. ونود أيضا أن نشكر جميع أعضاء مختبر أغيري على تعليقاتهم ونصائحهم القيمة.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| Other | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593 (2020).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
- Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
- Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
- Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
- Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
- Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
- Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
- Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
- Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
- Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
- Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
- Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
- Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
- Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
- Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
- Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
- Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).
- Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
- Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).
