Aplicação do movimento passivo da cabeça para gerar acelerações definidas nas cabeças dos roedores
Summary
O presente protocolo descreve um sistema personalizado de “movimento passivo da cabeça”, que reproduz acelerações mecânicas nas cabeças dos roedores geradas durante a corrida em esteira a velocidades moderadas. Permite dissecar fatores/elementos mecânicos dos efeitos benéficos do exercício físico.
Abstract
O exercício é amplamente reconhecido como eficaz para várias doenças e distúrbios físicos, incluindo aqueles relacionados à disfunção cerebral. No entanto, os mecanismos moleculares por trás dos efeitos benéficos do exercício são pouco compreendidos. Muitos exercícios físicos, particularmente aqueles classificados como exercícios aeróbicos, como correr e caminhar, produzem forças impulsivas no momento do contato do pé com o solo. Portanto, especulou-se que o impacto mecânico poderia estar implicado em como o exercício contribui para a homeostase do organismo. Para testar essa hipótese no cérebro, foi desenvolvido um sistema personalizado de “movimento passivo da cabeça” (doravante referido como PHM) que pode gerar acelerações verticais com magnitudes e modos controlados e definidos e reproduzir a estimulação mecânica que pode ser aplicada às cabeças de roedores durante a corrida em esteira a velocidades moderadas, uma intervenção típica para testar os efeitos do exercício em animais. Usando este sistema, foi demonstrado que o PHM recapitula a serotonina (5-hidroxitriptamina, doravante referida como 5-HT) receptor subtipo 2A (5-HT2A) sinalizando nos neurônios do córtex pré-frontal (PFC) de camundongos. Este trabalho fornece protocolos detalhados para a aplicação de PHM e medição de suas acelerações mecânicas resultantes em cabeças de roedores.
Introduction
O exercício é benéfico para tratar ou prevenir diversos distúrbios físicos, incluindo doenças do estilo de vida, como diabetes mellitus e hipertensão essencial1. Relacionado a isso, também foram acumuladas evidências sobre os efeitos positivos do exercício sobre as funções cerebrais2. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes aos benefícios do exercício para o cérebro permanecem principalmente não elucidados. A maioria das atividades físicas e treinos geram acelerações mecânicas na cabeça, pelo menos até certo ponto. Enquanto vários fenômenos fisiológicos são regulados mecanicamente, a importância da carga mecânica tem, na maioria dos casos, sido documentada no sistema musculoesquelético 3,4,5. Embora o cérebro também seja submetido a forças mecânicas durante as atividades físicas, particularmente os chamados exercícios de impacto, a regulação mecânica da função cerebral fisiológica raramente foi estudada. Como a geração de acelerações mecânicas na cabeça é relativamente comum aos exercícios físicos, especula-se que a regulação mecânica possa estar implicada nos benefícios do exercício para as funções cerebrais.
A sinalização do receptor 5-HT2A é essencial na regulação de emoções e comportamentos entre vários sinais bioquímicos que funcionam no sistema nervoso. Está envolvida em múltiplas doenças psiquiátricas 6,7,8, nas quais o exercício tem se mostrado terapeuticamente eficaz. O receptor 5-HT2A é um subtipo de receptor 5-HT2 que pertence à família da serotonina e também é um membro da família do receptor acoplado à proteína G (GPCR), cuja sinalização é modulada por sua internalização, dependente de ligantes ou independente9. O espasmo da cabeça é um comportamento característico dos roedores, cuja quantidade (frequência) representa explicitamente a intensidade da sinalização do receptor 5-HT2A em seus neurônios do córtex pré-frontal (PFC)10,11. Aproveitando a estrita especificidade desta resposta alucinógena à 5-HT administrada (resposta de contração da cabeça, doravante referida como HTR; ver Filme Suplementar 1), a hipótese mencionada acima sobre as implicações mecânicas nos efeitos do exercício nas funções cerebrais foi testada. Assim, analisamos e comparamos o HTR de camundongos submetidos a exercício forçado (corrida em esteira) ou intervenção mecânica que imita o exercício (PHM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando o sistema de aplicação PHM desenvolvido, mostramos que a sinalização 5-HT em seus neurônios PFC é regulada mecanicamente. Devido à complexidade dos efeitos do exercício, tem sido difícil dissecar com precisão as consequências do exercício no contexto da promoção da saúde. O foco está em aspectos mecânicos para impedir o envolvimento ou a contribuição de eventos metabólicos que possam ocorrer com ou posteriormente às atividades de exercício, como o consumo de energia. Espera-se que o método d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi em parte apoiado pelo Fundo de Pesquisa Intramural do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar do Japão; Subsídios em Auxílio à Investigação Científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Programa Apoiado pelo MEXT para a Fundação de Pesquisa Estratégica em Universidades Privadas, 2015-2019 do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão (S1511017); a Fundação de Ciência e Engenharia de Naito. Esta pesquisa também recebeu financiamento da Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), que é apoiada pelo Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) e National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de Prêmio P2CHD086843.
Materials
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
Referências
- Lackland, D. T., Voeks, J. H. Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management. Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).
- Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J. The effects of exercise training on elderly persons with cognitive impairment and dementia: a meta-analysis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 85 (10), 1694-1704 (2004).
- Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
- Sakitani, N., et al. Application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes. Journal of Visualized Experiments. (151), e59475 (2019).
- Miyazaki, T., et al. Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity. Scientific Advances. 5 (9), (2019).
- Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annual Review of Medicine. 60 (1), 355-366 (2009).
- Canli, T., Lesch, K. -. P. Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition. Nature Neuroscience. 10 (9), 1103-1109 (2007).
- Roth, B., Hanizavareh, S. M., Blum, A. Serotonin receptors represent highly favorable molecular targets for cognitive enhancement in schizophrenia and other disorders. Psychopharmacology. 174 (1), 17-24 (2003).
- Bhattacharyya, S., Puri, S., Miledi, R., Panicker, M. M. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14470-14475 (2002).
- Canal, C. E., Morgan, D. Head-twitch response in rodents induced by the hallucinogen 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine: a comprehensive history, a re-evaluation of mechanisms, and its utility as a model. Drug Testing and Analysis. 4 (7-8), 556-576 (2012).
- Halberstadt, A. L., Geyer, M. A. Characterization of the head-twitch response induced by hallucinogens in mice: detection of the behavior based on the dynamics of head movement. Psychopharmacology (Berl). 227 (4), 727-739 (2013).
- Kim, S. -. E., et al. Treadmill exercise prevents aging-induced failure of memory through an increase in neurogenesis and suppression of apoptosis in rat hippocampus. Experimental Gerontology. 45 (5), 357-365 (2010).
- Li, H., et al. Regular treadmill running improves spatial learning and memory performance in young mice through increased hippocampal neurogenesis and decreased stress. Brain Research. 1531, 1-8 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT2A receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Ryu, Y., et al. Mechanical regulation underlies effects of exercise on serotonin-induced signaling in the prefrontal cortex neurons. iScience. 23 (2), 100874 (2020).
- Shefer, G., Rauner, G., Stuelsatz, P., Benayahu, D., Yablonka-Reuveni, Z. Moderate-intensity treadmill running promotes expansion of the satellite cell pool in young and old mice. FEBS Journal. 280 (17), 4063-4073 (2013).
- Wang, J., et al. Moderate exercise has beneficial effects on mouse ischemic stroke by enhancing the functions of circulating endothelial progenitor cell-derived exosomes. Experimental Neurology. 330, 113325 (2020).
- Pacák, K. Stressor-specific activation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Physiological Research. 49, 11-17 (2000).
- Okamoto, M., Soya, H. Mild exercise model for enhancement of hippocampal neurogenesis: A possible candidate for promotion of neurogenesis. The Journal of Physical Fitness and Sports Medicine. 1 (4), 585-594 (2012).
