げっ歯類の頭部に定義された加速度を生成するための受動的頭部運動の適用
Summary
本プロトコルは、適度な速度で走行しているトレッドミル中に発生するげっ歯類の頭部での機械的加速度を再現する、カスタム設計された「パッシブヘッドモーション」システムについて説明しています。それは身体運動の有益な効果から機械的要因/要素を解剖することを可能にします。
Abstract
運動は、脳機能障害に関連するものを含むさまざまな病気や身体障害に効果的であると広く認識されています。しかし、運動の有益な効果の背後にある分子メカニズムはよくわかっていません。多くの身体トレーニング、特にジョギングやウォーキングなどの有酸素運動に分類されるトレーニングは、地面との足の接触時に衝動的な力を生み出します。したがって、運動が生物の恒常性にどのように寄与するかには、機械的影響が関係しているのではないかと推測されました。この仮説を脳で検証するために、制御され定義された大きさとモードで垂直加速度を生成し、中程度の速度で走るトレッドミル中にげっ歯類の頭に適用される可能性のある機械的刺激を再現できるカスタム設計された「パッシブヘッドモーション」(以下、PHMと呼びます)システムが開発されました動物における運動の効果をテストするための典型的な介入。このシステムを使用することにより、PHMがマウスの前頭前野(PFC)ニューロンにおけるセロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、以下、5-HTと呼ぶ)受容体サブタイプ2A(5-HT2A)シグナル伝達を再現することが実証されました。この研究は、PHMを適用し、げっ歯類の頭で結果として生じる機械的加速度を測定するための詳細なプロトコルを提供します。
Introduction
運動は、糖尿病や本態性高血圧症などの生活習慣病を含むいくつかの身体障害を治療または予防するのに有益です1。これに関連して、運動が脳機能に及ぼすプラスの効果に関する証拠も蓄積されています2。しかし、脳にとっての運動の利点の根底にある分子メカニズムは、主に未解明のままです。ほとんどの身体活動やトレーニングは、少なくともある程度は、頭に機械的加速を生成します。さまざまな生理学的現象が機械的に制御されているのに対し、機械的負荷の重要性は、ほとんどの場合、筋骨格系で文書化されています3,4,5。脳は身体活動、特にいわゆる衝撃運動中にも機械的な力を受けますが、生理学的脳機能の機械的調節はほとんど研究されていません。頭部での機械的加速度の生成は身体的なトレーニングに比較的一般的であるため、機械的調節は脳機能に対する運動の利点に関係している可能性があると推測されています。
5-HT2A受容体シグナル伝達は、神経系で機能する様々な生化学的シグナルの中でも感情や行動を調節するのに不可欠です。それは複数の精神疾患に関与しています6,7,8、運動は治療的に効果的であることが証明されています。5-HT2A受容体は、セロトニンファミリーに属する5-HT2受容体のサブタイプであり、Gタンパク質共役受容体(GPCR)ファミリーのメンバーでもあり、そのシグナル伝達は、リガンド依存性または非依存性のいずれかのその内在化によって調節される9。頭部のけいれんはげっ歯類の特徴的な行動であり、その量(頻度)は、前頭前野(PFC)ニューロンにおける5-HT2A受容体シグナル伝達の強度を明示的に表しています10,11。投与された5-HT(頭筋反応、以下HTRと呼ぶ;補足動画1を参照)に対するこの幻覚反応の厳密な特異性を利用して、脳機能に対する運動効果の機械的影響に関する上記の仮説が検証されました。したがって、強制運動(トレッドミルランニング)または運動模倣機械的介入(PHM)のいずれかを受けたマウスのHTRを解析および比較しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
開発したPHM応用システムを用いて、PFCニューロンの5-HTシグナル伝達が機械的に制御されていることを示しました。運動効果は複雑であるため、健康増進の文脈で運動の結果を正確に分析することは困難でした。焦点は、エネルギー消費などの運動活動に伴って、またはその後に発生する可能性のある代謝イベントの関与または寄与を排除するための機械的側面にあります。ここで説明した方…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業の一部は、日本の厚生労働省の学内研究費の支援を受けました。日本学術振興会科学研究費助成事業 (科学研究費助成事業 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367);文部科学省 文部科学省 戦略的研究財団 2015-2019 (S1511017)内藤科学技術振興財団.この研究はまた、Eunice Kennedy Shriver国立小児保健人間発達研究所(NICHD)、国立神経障害・脳卒中研究所(NINDS)、および国立衛生研究所の国立生物医学画像生物工学研究所(NIBIB)の支援を受けているAlliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training(AR3T)からも資金提供を受けています。
Materials
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
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