Il presente protocollo descrive un sistema di “movimento passivo della testa” progettato su misura, che riproduce le accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori generate durante il loro tapis roulant che corre a velocità moderate. Permette di sezionare fattori/elementi meccanici dagli effetti benefici dell’esercizio fisico.
L’esercizio fisico è ampiamente riconosciuto come efficace per varie malattie e disturbi fisici, compresi quelli legati alla disfunzione cerebrale. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base degli effetti benefici dell’esercizio fisico sono poco conosciuti. Molti allenamenti fisici, in particolare quelli classificati come esercizi aerobici come jogging e camminata, producono forze impulsive al momento del contatto del piede con il terreno. Pertanto, è stato ipotizzato che l’impatto meccanico potrebbe essere implicato nel modo in cui l’esercizio contribuisce all’omeostasi dell’organismo. Per testare questa ipotesi sul cervello, è stato sviluppato un sistema di “movimento passivo della testa” progettato su misura (di seguito denominato PHM) in grado di generare accelerazioni verticali con grandezze e modalità controllate e definite e riprodurre la stimolazione meccanica che potrebbe essere applicata alle teste dei roditori durante la corsa del tapis roulant a velocità moderate, un tipico intervento per testare gli effetti dell’esercizio fisico negli animali. Utilizzando questo sistema, è stato dimostrato che PHM ricapitola la segnalazione del recettore della serotonina (5-idrossitriptamina, di seguito denominata 5-HT) sottotipo 2A (5-HT2A) nei neuroni della corteccia prefrontale (PFC) dei topi. Questo lavoro fornisce protocolli dettagliati per l’applicazione del PHM e la misurazione delle conseguenti accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori.
L’esercizio fisico è utile per trattare o prevenire diversi disturbi fisici, tra cui malattie legate allo stile di vita come il diabete mellito e l’ipertensione essenziale1. In relazione a questo, sono state accumulate anche prove per quanto riguarda gli effetti positivi dell’esercizio sulle funzioni cerebrali2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dei benefici dell’esercizio fisico per il cervello rimangono principalmente non chiariti. La maggior parte delle attività fisiche e degli allenamenti generano accelerazioni meccaniche alla testa, almeno in una certa misura. Mentre vari fenomeni fisiologici sono regolati meccanicamente, l’importanza del carico meccanico è stata, nella maggior parte dei casi, documentata nel sistema muscolo-scheletrico 3,4,5. Sebbene il cervello sia anche soggetto a forze meccaniche durante le attività fisiche, in particolare i cosiddetti esercizi di impatto, la regolazione meccanica della funzione cerebrale fisiologica è stata raramente studiata. Poiché la generazione di accelerazioni meccaniche alla testa è relativamente comune agli allenamenti fisici, è stato ipotizzato che la regolazione meccanica potrebbe essere implicata nei benefici dell’esercizio fisico per le funzioni cerebrali.
La segnalazione del recettore 5-HT2A è essenziale nella regolazione delle emozioni e dei comportamenti tra i vari segnali biochimici che funzionano nel sistema nervoso. È coinvolto in molteplici malattie psichiatriche 6,7,8, su cui l’esercizio fisico ha dimostrato di essere terapeuticamente efficace. Il recettore 5-HT2A è un sottotipo del recettore 5-HT2 che appartiene alla famiglia della serotonina ed è anche un membro della famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR), la cui segnalazione è modulata dalla sua internalizzazione, ligando-dipendente o -indipendente9. La contrazione della testa è un comportamento caratteristico dei roditori, la cui quantità (frequenza) rappresenta esplicitamente l’intensità della segnalazione del recettore 5-HT2A nei loro neuroni della corteccia prefrontale (PFC)10,11. Sfruttando la stretta specificità di questa risposta allucinogena alla 5-HT somministrata (risposta a contrazione della testa, di seguito denominata HTR; vedi filmato supplementare 1), è stata testata l’ipotesi sopra menzionata sulle implicazioni meccaniche negli effetti dell’esercizio sulle funzioni cerebrali. Pertanto, abbiamo analizzato e confrontato l’HTR di topi sottoposti a esercizio forzato (corsa su tapis roulant) o intervento meccanico che imita l’esercizio (PHM).
Utilizzando il sistema di applicazione PHM sviluppato, abbiamo dimostrato che la segnalazione 5-HT nei loro neuroni PFC è regolata meccanicamente. A causa della complessità degli effetti dell’esercizio, è stato difficile analizzare con precisione le conseguenze dell’esercizio nel contesto della promozione della salute. L’attenzione si concentra sugli aspetti meccanici per impedire il coinvolgimento o il contributo di eventi metabolici che possono verificarsi con o successivamente alle attività di esercizio, come il c…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Fondo di ricerca intramurale del Ministero giapponese della salute, del lavoro e del welfare; sovvenzioni per la ricerca scientifica della Società giapponese per la promozione della scienza (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Programma supportato da MEXT per la Fondazione di ricerca strategica presso università private, 2015-2019 dal Ministero giapponese dell’istruzione, della cultura, dello sport, della scienza e della tecnologia (S1511017); la Naito Science & Engineering Foundation. Questa ricerca ha anche ricevuto finanziamenti dall’Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), che è supportata dall’Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) e dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) del National Institutes of Health con il numero di premio P2CHD086843.
5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |