Applicazione del movimento passivo della testa per generare accelerazioni definite alle teste dei roditori
Summary
Il presente protocollo descrive un sistema di “movimento passivo della testa” progettato su misura, che riproduce le accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori generate durante il loro tapis roulant che corre a velocità moderate. Permette di sezionare fattori/elementi meccanici dagli effetti benefici dell’esercizio fisico.
Abstract
L’esercizio fisico è ampiamente riconosciuto come efficace per varie malattie e disturbi fisici, compresi quelli legati alla disfunzione cerebrale. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base degli effetti benefici dell’esercizio fisico sono poco conosciuti. Molti allenamenti fisici, in particolare quelli classificati come esercizi aerobici come jogging e camminata, producono forze impulsive al momento del contatto del piede con il terreno. Pertanto, è stato ipotizzato che l’impatto meccanico potrebbe essere implicato nel modo in cui l’esercizio contribuisce all’omeostasi dell’organismo. Per testare questa ipotesi sul cervello, è stato sviluppato un sistema di “movimento passivo della testa” progettato su misura (di seguito denominato PHM) in grado di generare accelerazioni verticali con grandezze e modalità controllate e definite e riprodurre la stimolazione meccanica che potrebbe essere applicata alle teste dei roditori durante la corsa del tapis roulant a velocità moderate, un tipico intervento per testare gli effetti dell’esercizio fisico negli animali. Utilizzando questo sistema, è stato dimostrato che PHM ricapitola la segnalazione del recettore della serotonina (5-idrossitriptamina, di seguito denominata 5-HT) sottotipo 2A (5-HT2A) nei neuroni della corteccia prefrontale (PFC) dei topi. Questo lavoro fornisce protocolli dettagliati per l’applicazione del PHM e la misurazione delle conseguenti accelerazioni meccaniche alle teste dei roditori.
Introduction
L’esercizio fisico è utile per trattare o prevenire diversi disturbi fisici, tra cui malattie legate allo stile di vita come il diabete mellito e l’ipertensione essenziale1. In relazione a questo, sono state accumulate anche prove per quanto riguarda gli effetti positivi dell’esercizio sulle funzioni cerebrali2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dei benefici dell’esercizio fisico per il cervello rimangono principalmente non chiariti. La maggior parte delle attività fisiche e degli allenamenti generano accelerazioni meccaniche alla testa, almeno in una certa misura. Mentre vari fenomeni fisiologici sono regolati meccanicamente, l’importanza del carico meccanico è stata, nella maggior parte dei casi, documentata nel sistema muscolo-scheletrico 3,4,5. Sebbene il cervello sia anche soggetto a forze meccaniche durante le attività fisiche, in particolare i cosiddetti esercizi di impatto, la regolazione meccanica della funzione cerebrale fisiologica è stata raramente studiata. Poiché la generazione di accelerazioni meccaniche alla testa è relativamente comune agli allenamenti fisici, è stato ipotizzato che la regolazione meccanica potrebbe essere implicata nei benefici dell’esercizio fisico per le funzioni cerebrali.
La segnalazione del recettore 5-HT2A è essenziale nella regolazione delle emozioni e dei comportamenti tra i vari segnali biochimici che funzionano nel sistema nervoso. È coinvolto in molteplici malattie psichiatriche 6,7,8, su cui l’esercizio fisico ha dimostrato di essere terapeuticamente efficace. Il recettore 5-HT2A è un sottotipo del recettore 5-HT2 che appartiene alla famiglia della serotonina ed è anche un membro della famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR), la cui segnalazione è modulata dalla sua internalizzazione, ligando-dipendente o -indipendente9. La contrazione della testa è un comportamento caratteristico dei roditori, la cui quantità (frequenza) rappresenta esplicitamente l’intensità della segnalazione del recettore 5-HT2A nei loro neuroni della corteccia prefrontale (PFC)10,11. Sfruttando la stretta specificità di questa risposta allucinogena alla 5-HT somministrata (risposta a contrazione della testa, di seguito denominata HTR; vedi filmato supplementare 1), è stata testata l’ipotesi sopra menzionata sulle implicazioni meccaniche negli effetti dell’esercizio sulle funzioni cerebrali. Pertanto, abbiamo analizzato e confrontato l’HTR di topi sottoposti a esercizio forzato (corsa su tapis roulant) o intervento meccanico che imita l’esercizio (PHM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il sistema di applicazione PHM sviluppato, abbiamo dimostrato che la segnalazione 5-HT nei loro neuroni PFC è regolata meccanicamente. A causa della complessità degli effetti dell’esercizio, è stato difficile analizzare con precisione le conseguenze dell’esercizio nel contesto della promozione della salute. L’attenzione si concentra sugli aspetti meccanici per impedire il coinvolgimento o il contributo di eventi metabolici che possono verificarsi con o successivamente alle attività di esercizio, come il c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Fondo di ricerca intramurale del Ministero giapponese della salute, del lavoro e del welfare; sovvenzioni per la ricerca scientifica della Società giapponese per la promozione della scienza (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Programma supportato da MEXT per la Fondazione di ricerca strategica presso università private, 2015-2019 dal Ministero giapponese dell’istruzione, della cultura, dello sport, della scienza e della tecnologia (S1511017); la Naito Science & Engineering Foundation. Questa ricerca ha anche ricevuto finanziamenti dall’Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), che è supportata dall’Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) e dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) del National Institutes of Health con il numero di premio P2CHD086843.
Materials
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
Referências
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