जलीय आवासों से हाइड्रोकार्बन मेटाबोलाइज़िंग गुणों के साथ जीवाणु प्रजातियों का अलगाव, प्रसार और पहचान
Summary
हम जलीय आवासों से हाइड्रोकार्बन-अपमानजनक बैक्टीरिया को अलग करने, प्रचार करने और चिह्नित करने की प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल बैक्टीरिया अलगाव, 16 एस आरआरएनए विधि द्वारा पहचान और उनकी हाइड्रोकार्बन-अपमानजनक क्षमता के परीक्षण को रेखांकित करता है। यह लेख शोधकर्ताओं को पर्यावरणीय नमूनों में माइक्रोबियल जैव विविधता को चिह्नित करने में मदद करेगा, और विशेष रूप से बायोरेमेडिएशन क्षमता वाले रोगाणुओं के लिए स्क्रीन करेगा।
Abstract
हाइड्रोकार्बन प्रदूषक क्षरण के लिए उद्दंड हैं और पर्यावरण में उनका संचय सभी जीवन रूपों के लिए विषाक्त है। बैक्टीरिया कई उत्प्रेरक एंजाइमों को एन्कोड करते हैं और स्वाभाविक रूप से हाइड्रोकार्बन को चयापचय करने में सक्षम होते हैं। वैज्ञानिक बायोडिग्रेडेशन और बायोरेमेडिएशन क्षमता के साथ बैक्टीरिया को अलग करने के लिए जलीय पारिस्थितिक तंत्र में जैव विविधता का उपयोग करते हैं। पर्यावरण से इस तरह के आइसोलेट्स चयापचय मार्गों और एंजाइमों का एक समृद्ध सेट प्रदान करते हैं, जिनका उपयोग औद्योगिक पैमाने पर गिरावट की प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। इस लेख में, हम जलीय आवासों से जीवाणु प्रजातियों के अलगाव, प्रसार और पहचान की सामान्य प्रक्रिया को रेखांकित करते हैं और सरल तकनीकों का उपयोग करके विट्रो में एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में हाइड्रोकार्बन का उपयोग करने की उनकी क्षमता को स्क्रीन करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल 16 एस आरआरएनए विश्लेषण का उपयोग करके विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के अलगाव और उनकी बाद की पहचान का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल बैक्टीरियल आइसोलेट्स की हाइड्रोकार्बन अपमानजनक क्षमता को चिह्नित करने के लिए कदम भी प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा जो अपने जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए पर्यावरणीय आवासों से जीवाणु प्रजातियों को अलग करने की कोशिश कर रहे हैं।
Introduction
हाइड्रोकार्बन (एचसी) का बड़े पैमाने पर ईंधन और रासायनिक अनुप्रयोगों दोनों में उपयोग किया जाता है। बेंजीन, टोल्यूनि और जाइलीन जैसे सुगंधित हाइड्रोकार्बन का उपयोग सॉल्वैंट्स1 के रूप में व्यापक रूप से किया जाता है। एथिलीन और प्रोपलीन जैसे एल्केन्स क्रमशः पॉलीथीन और पॉलीप्रोपाइलीन पॉलिमर के संश्लेषण में अग्रदूत के रूप में काम करते हैं। एक अन्य हाइड्रोकार्बन, स्टाइरीन का पोलीमराइजेशन पॉलीस्टाइनिन बनाता है। मानवजनित गतिविधियाँ अपने उत्पादन और परिवहन के दौरान पर्यावरण में हाइड्रोकार्बन पेश करती हैं। मिट्टी और पानी के हाइड्रोकार्बन संदूषण से पर्यावरण और मानव स्वास्थ्य के लिए गंभीर चिंताएं हैं। सूक्ष्मजीव जैव-रासायनिक चक्रों को विनियमित करके और सब्सट्रेट्स की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करके पारिस्थितिकी तंत्र को बनाए रखने में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जिसमें प्रदूषक और ज़ेनोबायोटिक्स भी शामिल हैं, उन्हें कार्बन और ऊर्जा स्रोत में परिवर्तित करते हैं। सूक्ष्मजीवों द्वारा पर्यावरणीय दूषित पदार्थों के विषहरण की इस प्रक्रिया को बायोरेमेडिएशन 3,4,5,6,7 के रूप में जाना जाता है।
हाइड्रोकार्बन को नीचा दिखाने की क्षमता वाले सूक्ष्मजीव जलीय और मिट्टी के आवास 8,9,10 में पाए जाते हैं। अल्केन्स और सुगंधित एचसी को नीचा दिखाने की क्षमता वाले कई बैक्टीरिया की पहचान की गई है, जैसे कि स्यूडोमोनास, एसिनेटोबैक्टर, रोडोकोकस, मैरिनोबैक्टर और ओलीबैक्टर11। तकनीकी रूप से उन्नत संस्कृति-स्वतंत्र दृष्टिकोणों के विकास ने नए एचसी-अपमानजनकमाइक्रोबियल समुदायों की खोज में मदद की है। स्रोत नमूनों से सीधे पृथक जीनोमिक सामग्री को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) जैसे उच्च थ्रूपुट विधियों द्वारा प्रवर्धित और अनुक्रमित किया जाता है, जिसके बाद सूक्ष्मजीवों की खेती करने की आवश्यकता को समाप्त करने वाला विश्लेषण किया जाता है। एनजीएस विधियां, जैसे मेटाजीनोम विश्लेषण, महंगी हैं और प्रवर्धन प्रक्रिया13 से संबंधित कमियों से ग्रस्त हैं। चुनिंदा संवर्धन संस्कृति14 जैसी खेती की तकनीकें जो हाइड्रोकार्बन-अपमानजनक रोगाणुओं के अलगाव को लक्षित करती हैं, अभी भी उपयोगी हैं क्योंकि वे शोधकर्ताओं को बैक्टीरिया आइसोलेट्स में चयापचय मार्गों की जांच और हेरफेर करने की अनुमति देते हैं।
जीनोमिक डीएनए अलगाव और बाद में जीनोमिक सामग्री के अनुक्रमण से किसी भी जीव के बारे में मूल्यवान जानकारी का पता चलता है। संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण जीन की पहचान में मदद करता है जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध, संभावित दवा लक्ष्य, विषाणु कारक, ट्रांसपोर्टर्स, ज़ेनोबायोटिक-मेटाबोलाइज़िंग एंजाइम आदिके लिए कोड करता है। 16एसआरआरएनए एन्कोडिंग जीन का अनुक्रमण बैक्टीरियल फ़ाइलोजेनी की पहचान करने के लिए एक मजबूत तकनीक साबित हुई है। वर्षों से जीन अनुक्रम और कार्य का संरक्षण इसे अज्ञात बैक्टीरिया की पहचान करने और निकटतम प्रजातियों के साथ एक अलग की तुलना करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण बनाता है। इसके अलावा, इस जीन की लंबाई जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण18 के लिए इष्टतम है। सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग करके जीन प्रवर्धन में आसानी और जीन अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में सुधार के साथ ये सभी विशेषताएं इसे रोगाणुओं की पहचान के लिए एक स्वर्ण मानक बनाती हैं।
यहां, हम पर्यावरणीय नमूनों से एचसी-अपमानजनक क्षमता वाले खेती योग्य सूक्ष्मजीवों को पुनर्प्राप्त करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। नीचे वर्णित विधि एचसी-डिग्रेडिंग बैक्टीरिया के संग्रह और पहचान को रेखांकित करती है और इसे पांच वर्गों में विभाजित किया गया है: (1) पानी के नमूनों से बैक्टीरिया का संग्रह, (2) शुद्ध संस्कृतियों का अलगाव, (3) बैक्टीरियल आइसोलेट्स की एचसी-डिग्रेडिंग क्षमता की खोज (4) जीनोमिक डीएनए अलगाव, और (5) 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण और ब्लास्ट विश्लेषण के आधार पर पहचान। इस प्रक्रिया को कई अलग-अलग जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए बैक्टीरिया को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि पृथ्वी पर केवल लगभग 1% बैक्टीरियाको प्रयोगशाला 6 में आसानी से खेती की जा सकती है। यहां तक कि खेती योग्य बैक्टीरिया के बीच, कई लोग अचिह्नित रहते हैं। आणविक विधियों मे?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ कार्तिक कृष्णन और आरपी लैब के सदस्यों को उनकी उपयोगी टिप्पणियों और सुझावों के लिए धन्यवाद देते हैं। डीएस एसएनयू-डॉक्टरेट फैलोशिप और अर्थवॉच इंस्टीट्यूट इंडिया फैलोशिप द्वारा समर्थित है। आरपी लैब को सीएसआईआर-ईएमआर अनुदान और शिव नादर विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
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