בדיקת מיקרו-פטרנינג למדידת כיראליות תאים
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לקביעת כיראליות רב-תאית במבחנה, תוך שימוש בטכניקת המיקרו-פטרינג. בדיקה זו מאפשרת כימות אוטומטי של הטיות שמאל-ימין של סוגים שונים של תאים וניתן להשתמש בה למטרות סינון.
Abstract
כיראליות היא תכונה תאית פנימית, המתארת את האסימטריה במונחים של קיטוב לאורך ציר שמאל-ימין של התא. מכיוון שתכונה ייחודית זו מושכת תשומת לב גוברת בשל תפקידיה החשובים הן בהתפתחות והן במחלות, שיטת כימות סטנדרטית לאפיון כיראליות תאים תקדם את המחקר ואת היישומים הפוטנציאליים. בפרוטוקול זה אנו מתארים בדיקה של אפיון כיראליות רב-תאית המשתמשת במערכים מיקרו-פטרתיים של תאים. מיקרו-פטרנים סלולריים מיוצרים על שקופיות זכוכית מצופים טיטניום/זהב באמצעות הדפסה מיקרו-קונקרטית. לאחר זריעה על האיים המוגדרים באופן גיאומטרי (למשל, בצורת טבעת), המצופים בחלבון, התאים נודדים בכיוון ויוצרים יישור מוטה לכיוון הכיוון השעון או לכיוון נגד כיוון השעון, אותו ניתן לנתח ולכמת באופן אוטומטי על ידי תוכנית MATLAB שנכתבה בהתאמה אישית. כאן אנו מתארים בפירוט את הייצור של מצעים micropatterned, זריעת תאים, איסוף תמונות וניתוח נתונים ומציגים תוצאות מייצגות שהושגו באמצעות תאי NIH/3T3. פרוטוקול זה אומת בעבר במספר מחקרים שפורסמו והוא כלי יעיל ואמין לחקר כיראליות תאים במבחנה.
Introduction
אסימטריה שמאל-ימין (LR) של התא, הידועה גם בשם ידיים תאיות או כיראליות, מתארת את קוטביות התא בציר LR ומוכרת כתכונה ביופיזית בסיסית, שמורה, 1,2,3,4,5. כיראליות התא נצפתה הן in vivo והן in vitro במספר קשקשים. ממצאים קודמים חשפו מערבולת כיראלית של שלד אקטין ציטוסקלטון בתאים בודדים שנזרעו באיים עגולים6, נדידה ויישור מוטים של תאים בתוך גבולות מוגבלים 7,8,9,10,11, ולולאה א-סימטרית של צינור חום עוף 12.
ברמה הרב-תאית, כיראליות התאים יכולה להיקבע מתוך נדידה או יישור כיווניים, סיבוב תאי, דינמיקה של השלד הציטוסקטלי ומיקום אברוני התא 7,8,9,10,11,12,13. הקמנו בדיקה מבוססת מיקרו-פטרינגשל 14 כדי לאפיין ביעילות את ההטיה הכיראלית של תאים דביקים 7,8,9,10. כאשר המיקרו-פטרנים בצורת טבעת מגבילים באופן גיאומטרי את צבירי התאים, התאים מפגינים יחד נדידה כיוונית ויישור מוטה. תוכנית MATLAB פותחה כדי לזהות ולמדוד באופן אוטומטי את יישור התאים בתמונות של ניגודיות פאזה של הטבעת. כיוון יישור התאים המקומיים מכמת בזווית מוטה, בהתאם לסטייתו מהכיוון ההיקפי. לאחר ניתוח סטטיסטי, תבנית הטבעת של התאים מוגדרת כהטיות נגד כיוון השעון (CCW) או כהטיות בכיוון השעון (CW).
בדיקה זו שימשה לאפיון הכיראליות של פנוטיפים של תאים מרובים (טבלה 1), והאסימטריה LR של תאים נמצאה כ-7,11,15 ספציפיים לפנוטיפ. יתר על כן, הפרעה לדינמיקה ולמורפולוגיה של אקטין יכולה לגרום להיפוך של הטיה כיראלית 7,8, ועקה חמצונית יכולה לשנות גם את כיראליותהתאים 9. בגלל הפשטות של ההליך והחוסן של הגישה 7,8,9,10, בדיקת כיראליות דו-ממדית זו מספקת כלי יעיל ואמין לקביעה ולימוד כיראליות רב-תאית במבחנה.
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש בשיטה זו כדי לאפיין את כיראליות התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר מערכים תאיים עם דוגמאות באמצעות טכניקת הדפסה מיקרו-קונטקונטקטית ולבצע ניתוח כיראליות באופן אוטומטי באמצעות תוכנית MATLAB.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקת התבניות בצורת טבעת המתוארת כאן מספקת כלי קל לשימוש לאפיון כמותי של כיראליות רב-תאית, המסוגלת להפיק תוצאות אמינות ביותר וניתנות לחזרה. ייצור מהיר של מיקרו-סביבה מוגדרת זהה וניתוח בלתי מוטה מאפשר עיבוד אוטומטי בתפוקה גבוהה של דגימות בגודל גדול. פרוטוקול זה דן בייצור המיקרו-פטרנים הטב?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (OD /NICHD DP2HD083961 ו- NHBLI R01HL148104). ליאו ק. וואן הוא חוקר פיו במדעים ביו-רפואיים (PEW 00026185), הנתמך על ידי נאמנויות הצדקה של פיו. האוקאנג ג’אנג נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (20PRE35210243).
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
Referências
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer’s disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021)
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
