הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מייעל את שיטות זילוח / דה-צלולריזציה באתרו של הכבד ושיטות מיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי ליצור פלטפורמה אמינה להמחשת הדינמיקה של עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM) במהלך סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH).
Abstract
סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) היא מחלת הכבד הכרונית הנפוצה ביותר בארצות הברית, המשפיעה על יותר מ -70 מיליון אמריקאים. NASH יכול להתקדם לפיברוזיס ובסופו של דבר לשחמת הכבד, גורם סיכון משמעותי לקרצינומה הפטוצלולרית. המטריצה החוץ תאית (ECM) מספקת תמיכה מבנית ושומרת על הומאוסטזיס בכבד באמצעות אותות מטריתיים. פיברוזיס בכבד נובע מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של ECM ומאופיין בהצטברות יתר של אלמנטים מבניים ושינויים נלווים בגליקוזאמינוגליקנים. דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא “חוט עוף”, אשר בדרך כלל מורכב מפיברוזיס perisinusoidal/pericellular zone 3, בהתבסס על תכונות שנצפו על ידי כתם טריכרום של Masson וכתמים אדומים Picrosirius. עם זאת, טכניקות הדמיה מסורתיות דו-ממדיות (2D) מבוססות שקופיות רקמה אינן יכולות להדגים את השינויים המבניים המפורטים של ECM תלת-ממדי (3D), ומגבילים את ההבנה של עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד.
העבודה הנוכחית אופטימיזציה פרוטוקול מהיר ויעיל כדי לדמות את מבנה ECM המקורי בכבד באמצעות decellularization כדי להתמודד עם האתגרים לעיל. עכברים הוזנו בצ’או או במזון מהיר במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו , וטכניקות המיקרוסקופ הדו-פוטוני יושמו כדי לצלם ולנתח שינויים ב-ECM המקורי. התמונות התלת-ממדיות של הכבד הנורמלי והכבד NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום על ידי מיקרוסקופ של שני פוטונים סיפקו פלטפורמה מעשית ואמינה לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.
Introduction
מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא מחלת הכבד הנפוצה ביותר, המשפיעה על 20%-25% מהאוכלוסייה הבוגרת. 25% מחולי NAFLD מתקדמים לסטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), שם הסיכון לשחמת, אי ספיקת כבד וקרצינומה הפטוצלולרית עולה1. ב-20 השנים הבאות, ההערכה היא כי NASH יהיה אחראי ל-2 מיליון מקרי מוות הקשורים לכבד בארה”ב2. מכיוון שאין טיפולים מאושרים, יש צורך דחוף לפענח את המנגנונים הגורמים לפיברוזיס בכבד בחולי NASH ולפתח טיפול ממוקד3.
המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מיקרו-סביבה דינמית ומורכבת המפעילה תקשורת דו-כיוונית עם תאים כדי לווסת את הומאוסטזיס רקמות4. ECM הכבד מורכב מאלמנטים מבניים כגון פרוטאוגליקנים, קולגן, פיברונקטין (fibronectin), אלסטין וחלבונים לא מבניים אחרים (למשל, אולפקטומדין וטרומבוספונדין) כדי לספק תמיכה פיזית ומבנית4.
פיברוזיס בכבד היא תגובה כרונית לריפוי פצעים לנזק לכבד של אטיולוגיות שונות, כולל NASH3. היא נובעת מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של מטריצת ECM ומאופיינת בעודף חלבונים מבניים בכבד הפגוע4. פיברוגנזה תלויה בתקשורת התא-תא הדינמית בין סוגים שונים של תאי כבד. תאי סטלט בכבד (HSCs), כאשר הם מופעלים, מתמיינים לתאים דמויי מיופיברובלסטים המבטאים, נודדים ומתרבים של אקטין שריר חלק ומסנתזים חלבוני ECM כפעולה לסגירת פצעים. HSCs פעילים הם התאים המרכזיים מייצרי הקולגן בכבד1.
המנגנון המולקולרי של עיצוב מחדש של ECM, דפוסי פיברוזיס והקשר שלהם לאירועים תאיים אינם ברורים. עדיין נדרשת הבנה טובה יותר של מבנה ה-ECM התלת-ממדי (3D), למרות שטכניקות ספקטרומטריית מסות סייעו לנתח את הרכב החלבונים ECM4. באופן מסורתי, כתם הטריכרום של מאסון, הכתמים האדומים של פיקרו סיריוס והדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) בוצעו על קטעי כבד דקים דו-ממדיים (דו-ממדיים). דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא “חוט תרנגולת”, אשר משתרע לאזור 3 והוא פיברוזיס perisinusoidal/pericellular 5,6. עם זאת, חסרים מחקרים המתמקדים במבנה התלת-ממדי של הכבד הטבעי, במיוחד אלה שאינם כרוכים בחתך רקמות. גישות הדמיה חזקות לזיהוי דפוסים ומאפיינים של פיברוזיס במהלך עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד יחזקו באופן משמעותי את ההבנה של מנגנוני NASH ויזהו מטרות טיפוליות חדשות.
כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פרוטוקול מהיר ויעיל הותאם להדמיה של ECM הכבד המקורי באמצעות דה-צלולריזציה7. דה-צלולריזציה של כל הכבד היא גישה להסרת התוכן התאי בכבד תוך שמירה על רשת ECM תלת-ממדית מקורית באמצעות זילוח חומרי ניקוי. עכברים הוזנו בצ’או או בדיאטת מזון מהיר (FFD) במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו עם חומר ניקוי עדין וספיקות נמוכות כדי לשמר מבני קולגן תלת-סליליים ופיברילריים מקומיים. מיקרוסקופ שני פוטונים יושם כדי לנתח שינויים במבני קולגן ב- ECM. התמונות התלת-ממדיות של מבנה ה-ECM המקורי בכבדים רגילים ובכבדי NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום במיקרוסקופ של שני פוטונים מספק פלטפורמה מעשית ובמחיר סביר לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מראה כי דה-צלולריזציה באמצעות זילוח DOC באתרו בקצב זרימה נמוך משמרת את מבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי, ומספקת פלטפורמה אמינה וחסכונית ללכידת עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס כבד NASH. למרות שדה-צלולריזציה בוצעה בכבדים רגילים ופיברוטיים לפני זיהוי רכיבי ECM או יצ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים להיסוק פארק על העזרה הטכנית. מחקר זה נתמך על ידי מימון מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, ל- NJT), המכון הלאומי להזדקנות (NIA), NIH (1R01AG060726, ל- NJT). אנו מודים לג’ון מלהולנד וקיטי לי ממתקן הדימות למדעי התא במרכז בקמן על הסיוע הטכני בהדמיה במיקרוסקופ של שני פוטונים.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
Referências
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome – looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R. The matrix in cancer. Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
