Het huidige protocol optimaliseert de lever in situ perfusie / decellularisatie en twee-foton microscopie methoden om een betrouwbaar platform te creëren om de dynamiek van extracellulaire matrix (ECM) remodellering tijdens niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) te visualiseren.
Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) is de meest voorkomende chronische leverziekte in de Verenigde Staten, die meer dan 70 miljoen Amerikanen treft. NASH kan zich ontwikkelen tot fibrose en uiteindelijk tot cirrose, een belangrijke risicofactor voor hepatocellulair carcinoom. De extracellulaire matrix (ECM) biedt structurele ondersteuning en handhaaft de leverhomeostase via matricellulaire signalen. Leverfibrose is het gevolg van een onbalans in het dynamische ECM-remodelleringsproces en wordt gekenmerkt door overmatige accumulatie van structurele elementen en bijbehorende veranderingen in glycosaminoglycanen. Het typische fibrosepatroon van NASH wordt “kippengaas” genoemd, dat meestal bestaat uit zone 3 perisinusoïdale / pericellulaire fibrose, gebaseerd op kenmerken waargenomen door Masson’s trichrome vlek en Picrosirius Red-vlekken. Deze traditionele dunne tweedimensionale (2D) op weefseldia’s gebaseerde beeldvormingstechnieken kunnen echter niet de gedetailleerde driedimensionale (3D) ECM-structurele veranderingen aantonen, waardoor het begrip van de dynamische ECM-remodellering bij leverfibrose wordt beperkt.
Het huidige werk optimaliseerde een snel en efficiënt protocol om de oorspronkelijke ECM-structuur in de lever via decellularisatie in beeld te brengen om de bovenstaande uitdagingen aan te pakken. Muizen werden gedurende 14 weken gevoed met chow of fastfooddieet. Decellularisatie werd uitgevoerd na in situ portale aderperfusie en de twee-foton microscopietechnieken werden toegepast om veranderingen in de inheemse ECM de beeld te brengen en te analyseren. De 3D-beelden van de normale en NASH-levers werden gereconstitueerd en geanalyseerd. Het uitvoeren van in situ perfusiedecellularisatie en het analyseren van de steiger door twee-fotonenmicroscopie bood een praktisch en betrouwbaar platform om de dynamische ECM-remodellering de de lever te visualiseren.
Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is de meest voorkomende leverziekte, die 20% -25% van de volwassen bevolking treft. 25% van de NAFLD-patiënten evolueert naar niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), waarbij het risico op cirrose, leverfalen en hepatocellulair carcinoom toeneemt1. In de komende 20 jaar wordt geschat dat NASH verantwoordelijk zal zijn voor 2 miljoen levergerelateerde sterfgevallen in de VS2. Omdat er geen goedgekeurde behandelingen zijn, is er een dringende noodzaak om de mechanismen te ontcijferen die leverfibrose veroorzaken bij NASH-patiënten en een gerichte behandeling te ontwikkelen3.
De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamische, complexe micro-omgeving die bidirectionele communicatie met cellen uitoefent om weefselhomeostase te reguleren4. De lever-ECM is samengesteld uit structurele elementen zoals proteoglycanen, collageen, fibronectine, elastine en andere niet-structurele eiwitten (bijv. Olfactomedine en trombospondine) om fysieke en structurele ondersteuning te bieden4.
Leverfibrose is een chronische wondgenezingsreactie op leverschade van verschillende etiologieën, waaronder NASH3. Het is het gevolg van een onbalans in het dynamische ECM-matrixremodelleringsproces en wordt gekenmerkt door overmatige structurele eiwitten in de gewonde lever4. Fibrogenese is afhankelijk van de dynamische cel-cel communicatie tussen verschillende leverceltypen. Hepatische stellaatcellen (HSC’s), wanneer geactiveerd, differentiëren in Smooth Muscle Alpha 2 Actine-expresserende, migrerende en prolifererende myofibroblastachtige cellen en synthetiseren ECM-eiwitten als een wondsluitende actie. Geactiveerde HSC’s zijn de centrale collageenproducerende cellen in de lever1.
Het moleculaire mechanisme van ECM-remodellering, patronen van fibrose en hun relatie met cellulaire gebeurtenissen zijn niet duidelijk. Een beter begrip van de driedimensionale (3D) ECM-structuur is nog steeds nodig, hoewel massaspectrometrietechnieken hebben geholpen bij het analyseren van de ECM-eiwitsamenstelling4. Traditioneel zijn Masson’s trichrome vlek, Picro Sirius Red vlekken en tweede harmonische generatie (SHG) beeldvorming uitgevoerd op tweedimensionale (2D) dunne leversecties. Het typische fibrosepatroon van NASH wordt “kippengaas” genoemd, dat zich uitstrekt tot zone 3 en perisinusoïdale / pericellulaire fibrose 5,6 is. Er is echter een gebrek aan studies die zich richten op de 3D-structuur van de inheemse lever, met name die waarbij geen weefselsectie plaatsvindt. Robuuste beeldvormingsbenaderingen om patronen en kenmerken van fibrose te identificeren tijdens dynamische ECM-remodellering bij leverfibrose zouden het begrip van NASH-mechanismen aanzienlijk versterken en nieuwe therapeutische doelen identificeren.
Om deze uitdagingen aan te gaan, werd een snel en efficiënt protocol geoptimaliseerd om de inheemse lever-ECM in beeld te brengen via decellularisatie7. Decellularisatie van de hele lever is een benadering om de hepatische cellulaire inhoud te verwijderen met behoud van het oorspronkelijke 3D ECM-netwerk door middel van wasmiddelperfusie. Muizen kregen gedurende 14 weken chow of fastfooddieet (FFD). Decellularisatie werd uitgevoerd na in situ poortaderperfusie met mild reinigingsmiddel en lage stroomsnelheden om triple-spiraalvormige en inheemse fibrillaire collageenstructuren te behouden. Twee-fotonenmicroscopie werd toegepast om veranderingen in collageenstructuren in ECM te analyseren. De 3D-beelden van de oorspronkelijke ECM-structuur in normale en NASH-levers werden gereconstitueerd en geanalyseerd. Het uitvoeren van in situ perfusie decellularisatie en het analyseren van de steiger door twee-foton microscopie biedt een praktisch en betaalbaar platform om de dynamische ECM-remodellering de de lever te visualiseren.
Het huidige protocol toont aan dat decellularisatie door middel van een lage stroomsnelheid DOC in situ perfusie de frangible triple-helical en native fibrillaire collageenstructuren behoudt, waardoor een betrouwbaar en kosteneffectief platform wordt geboden om dynamische ECM-remodellering in NASH-leverfibrose vast te leggen. Hoewel decellularisatie werd uitgevoerd in normale en fibrotische levers voordat ECM-componenten werden geïdentificeerd of biologische scaffolds voor celkweek werden gegenereerd, is de dyn…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Hyesuk Park voor de technische hulp. Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, naar NJT), het National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, naar NJT). We zijn dankbaar voor Jon Mulholland en Kitty Lee van de Cell Sciences Imaging Facility in het Beckman Center voor technische assistentie bij de beeldvorming met twee fotonenmicroscopie.
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |