Imagerie 3D de la matrice extracellulaire hépatique dans un modèle murin de stéatohépatite non alcoolique
Summary
Le protocole actuel optimise les méthodes de perfusion/décellularisation in situ du foie et de microscopie à deux photons afin d’établir une plateforme fiable pour visualiser la dynamique du remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) au cours de la stéatohépatite non alcoolique (NASH).
Abstract
La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est la maladie hépatique chronique la plus courante aux États-Unis, affectant plus de 70 millions d’Américains. La NASH peut évoluer vers une fibrose et éventuellement vers une cirrhose, un facteur de risque important de carcinome hépatocellulaire. La matrice extracellulaire (MEC) fournit un soutien structurel et maintient l’homéostasie hépatique via des signaux matricellulaires. La fibrose hépatique résulte d’un déséquilibre dans le processus de remodelage dynamique de l’ECM et se caractérise par une accumulation excessive d’éléments structurels et des modifications associées des glycosaminoglycanes. Le schéma de fibrose typique de la NASH est appelé « fil de poulet », qui consiste généralement en une fibrose périsinusoïdale / péricellulaire de zone 3, basée sur les caractéristiques observées par la coloration trichrome de Masson et les taches rouge Picrosirius. Cependant, ces techniques traditionnelles d’imagerie bidimensionnelle mince (2D) basée sur des lames tissulaires ne peuvent pas démontrer les changements structurels détaillés de l’ECM tridimensionnelle (3D), ce qui limite la compréhension du remodelage dynamique de l’ECM dans la fibrose hépatique.
Les travaux actuels ont optimisé un protocole rapide et efficace pour imager la structure ECM native dans le foie via la décellularisation afin de relever les défis ci-dessus. Les souris ont été nourries avec du chow ou un régime de restauration rapide pendant 14 semaines. La décellularisation a été réalisée après perfusion in situ de la veine porte, et les techniques de microscopie à deux photons ont été appliquées pour imager et analyser les changements dans l’ECM natif. Les images 3D des foies normaux et NASH ont été reconstituées et analysées. La réalisation d’une décellularisation in situ de la perfusion et l’analyse de l’échafaudage par microscopie à deux photons ont fourni une plate-forme pratique et fiable pour visualiser le remodelage dynamique de l’ECM dans le foie.
Introduction
La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est la maladie hépatique la plus courante, affectant 20% à 25% de la population adulte. 25% des patients atteints de NAFLD évoluent vers une stéatohépatite non alcoolique (NASH), où le risque de cirrhose, d’insuffisance hépatique et de carcinome hépatocellulaire augmente1. Au cours des 20 prochaines années, on estime que la NASH représentera 2 millions de décès liés au foie aux États-Unis2. En l’absence de traitements homologués, il est urgent de décrypter les mécanismes responsables de la fibrose hépatique chez les patients NASH et de développer un traitement ciblé3.
La matrice extracellulaire (MCE) est un microenvironnement dynamique et complexe qui exerce une communication bidirectionnelle avec les cellules pour réguler l’homéostasie tissulaire4. La MEC hépatique est composée d’éléments structuraux tels que les protéoglycanes, le collagène, la fibronectine, l’élastine et d’autres protéines non structurelles (par exemple, l’olfactomedine et la thrombospondine) pour fournir un soutien physique et structurel4.
La fibrose hépatique est une réponse chronique à la cicatrisation des plaies aux lésions hépatiques de diverses étiologies, y compris la NASH3. Elle résulte d’un déséquilibre dans le processus dynamique de remodelage de la matrice ECM et se caractérise par un excès de protéines structurelles dans le foie blessé4. La fibrogenèse dépend de la communication dynamique cellule-cellule entre différents types de cellules hépatiques. Les cellules stellaires hépatiques (CSH), lorsqu’elles sont activées, se différencient en cellules de type myofibroblastes exprimant l’alpha 2 Smooth Muscle 2 et synthétisent les protéines ECM en tant qu’action de fermeture de la plaie. Les CSH activées sont les cellules centrales productrices de collagène dans le foie1.
Le mécanisme moléculaire du remodelage de l’ECM, les modèles de fibrose et leur relation avec les événements cellulaires ne sont pas clairs. Une meilleure compréhension de la structure tridimensionnelle (3D) de l’ECM est encore nécessaire, même si les techniques de spectrométrie de masse ont permis d’analyser la composition protéique de l’ECM4. Traditionnellement, la coloration trichrome de Masson, les taches rouge Picro Sirius et l’imagerie de deuxième génération harmonique (SHG) ont été réalisées sur des coupes de foie minces bidimensionnelles (2D). Le schéma de fibrose typique de la NASH est appelé « fil de poulet », qui s’étend à la zone 3 et est une fibrose périsinusoïdale / péricellulaire 5,6. Cependant, il y a eu un manque d’études axées sur la structure 3D du foie natif, en particulier celles qui n’impliquent pas de section tissulaire. Des approches d’imagerie robustes pour identifier les modèles et les caractéristiques de la fibrose tout au long du remodelage ECM dynamique dans la fibrose hépatique renforceraient considérablement la compréhension des mécanismes de la NASH et identifieraient de nouvelles cibles thérapeutiques.
Pour relever ces défis, un protocole rapide et efficace a été optimisé pour imager l’ECM hépatique native via la décellularisation7. La décellularisation du foie entier est une approche permettant d’éliminer le contenu cellulaire hépatique tout en maintenant le réseau ECM 3D natif grâce à la perfusion de détergent. Les souris ont été nourries avec du chow ou un régime de restauration rapide (FFD) pendant 14 semaines. La décellularisation a été réalisée après perfusion in situ de la veine porte avec un détergent doux et de faibles débits pour préserver les structures de collagène fibrillaire triple hélicoïdale et native. La microscopie à deux photons a été appliquée pour analyser les changements dans les structures de collagène dans l’ECM. Les images 3D de la structure ECM native dans les foies normaux et NASH ont été reconstituées et analysées. La réalisation d’une décellularisation par perfusion in situ et l’analyse de l’échafaudage par microscopie à deux photons fournissent une plate-forme pratique et abordable pour visualiser le remodelage dynamique de l’ECM dans le foie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel montre que la décellularisation par perfusion in situ DOC à faible débit préserve les structures de collagène fibrillaire tricoïdale et hélicoïdale frangible, fournissant une plate-forme fiable et rentable pour capturer le remodelage dynamique de l’ECM dans la fibrose hépatique NASH. Bien que la décellularisation ait été réalisée dans des foies normaux et fibrotiques avant d’identifier les composants de l’ECM ou de générer des échafaudages biologiques pour la culture ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Hyesuk Park pour l’aide technique. Cette recherche a été financée par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), le NIH (R01 2DK083283, au NJT), le National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, au NJT). Nous remercions Jon Mulholland et Kitty Lee du Cell Sciences Imaging Facility du Centre Beckman pour leur assistance technique dans l’imagerie par microscopie à deux photons.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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