O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).
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Artigo de método
Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A esteatohepatite não alcoólica (EHNA) é a doença hepática crônica mais comum nos Estados Unidos, afetando mais de 70 milhões de americanos. A EHNA pode evoluir para fibrose e, eventualmente, para cirrose, um importante fator de risco para carcinoma hepatocelular. A matriz extracelular (MEC) fornece suporte estrutural e mantém a homeostase hepática via sinais matricelulares. A fibrose hepática resulta de um desequilíbrio no processo de remodelamento dinâmico da MEC e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de elementos estruturais e alterações associadas nos glicosaminoglicanos. O padrão típico de fibrose da EHNA é chamado de "fio de galinha", que geralmente consiste em fibrose perissinusoidal/pericelular da zona 3, com base nas características observadas pela coloração tricrômico de Masson e pelo vermelho de Picrosirius. No entanto, essas técnicas tradicionais de imagem em lâminas de tecido fino bidimensional (2D) não podem demonstrar as alterações estruturais detalhadas da MEC tridimensional (3D), limitando a compreensão do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática.
O trabalho atual otimizou um protocolo rápido e eficiente para obter imagens da estrutura nativa da MEC no fígado via decelularização para enfrentar os desafios acima. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food por 14 semanas. A descelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta, e as técnicas de microscopia de dois fótons foram aplicadas para imagear e analisar as alterações na MEC nativa. As imagens 3D dos fígados normal e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização in situ da perfusão e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons forneceram uma plataforma prática e confiável para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.
Introdução
A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a doença hepática mais comum, afetando 20%-25% da população adulta. 25% dos pacientes com DHGNA evoluem para esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), onde o risco de cirrose, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular aumenta1. Nos próximos 20 anos, estima-se que a EHNA será responsável por 2 milhões de mortes relacionadas ao fígado nos EUA2. Como não existem tratamentos aprovados, há uma necessidade urgente de decifrar os mecanismos que causam fibrose hepática em pacientes com EHNA e desenvolver tratamento direcionado3.
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Protocolo
Os experimentos com animais são realizados de acordo com os procedimentos experimentais aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais (IACUCs) da Universidade de Stanford e do Hospital de Assuntos de Veteranos em Palo Alto. Camundongos C57BL/6J machos de 6-8 semanas de idade foram alimentados com ração ou dieta fast-food suplementada com 4,2% de xarope de milho com alto teor de frutose (ver Tabela de Materiais) em água potável por 14 semanas5. Os camundongos foram mantidos em gaiolas padrão em um ciclo escuro/claro de 12 horas.
1. Preparo cirúrgico e procedimentos de perfu....
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Resultados
As fibras colágenas foram detectadas com segunda geração harmônica e microscopia de dois fótons. O sinal é proveniente das estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. Não foram utilizados anticorpos específicos para analisar os subtipos de colágeno; no entanto, isso poderia ser adicionado à técnica de imagem.
Quando o tecido hepático é estudado sem descelularização, é difícil obter imagens de alta resolução da rede de colágeno (Figura 5A<.......
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Discussão
O presente protocolo mostra que a decelularização através de uma perfusão in situ de COD de baixa taxa de fluxo preserva as estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo, fornecendo uma plataforma confiável e econômica para capturar o remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática da EHNA. Embora a descelularização tenha sido realizada em fígados normais e fibróticos antes da identificação dos componentes da MEC ou da geração de scaffolds biológicos para cultura celular, a dinâmica do .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse referentes a este artigo.
Agradecimentos
Agradecemos ao Hyesuk Park pela ajuda técnica. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, para NJT), o Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA), NIH (1R01AG060726, para NJT). Agradecemos a Jon Mulholland e Kitty Lee, do Cell Sciences Imaging Facility do Beckman Center, pela assistência técnica com a imagem de microscopia de dois fótons.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 sutura | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xilazina) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | este medicamento para uso por ou por ordem de um veterinário licenciado. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATETER COM TECNOLOGIA BC | BD | ||
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Dieta de controle. Uma fórmula fixa, dieta não autoclavável fabricada com ingredientes de alta qualidade e projetada para apoiar a gestação, lactação e crescimento de roedores. |
| Dieta de fast-food (AIN76A Dieta Ocidental) | Teste | de Dieta 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Kit de Coloração de Hematoxilina e Eosina | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Kit Cirúrgico de Rato | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| INJEÇÃO DE CLORIDRATO DE CETAMINA | Vedco | NDC 50989-996-06 - frasco de 10 mL. | KetaVed foi clinicamente estudado em primatas subumanos, além das espécies listadas em Administração e Dosagem. |
| Leica SP5 vertical Confocal, multifóton | Conector Leica | SP5 | |
| Luer (torneira de três vias com SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Kit de Mancha Vermelha Picrosirius | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| aplicador com ponta de rayon | puritano | 25-806 1PR | |
| Desoxicolato de sódio | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Xarope | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
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| VECTASHIELD Meio de Montagem Antifade | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
Referências
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incid....
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Reimpressões e permissões
