Den nåværende protokollen optimaliserer leveren in situ perfusjon / decellularisering og to-foton mikroskopi metoder for å etablere en pålitelig plattform for å visualisere dynamikken i ekstracellulær matriks (ECM) remodeling under ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH).
Ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH) er den vanligste kroniske leversykdommen i USA, som påvirker mer enn 70 millioner amerikanere. NASH kan utvikle seg til fibrose og til slutt til skrumplever, en betydelig risikofaktor for hepatocellulært karsinom. Den ekstracellulære matriksen (ECM) gir strukturell støtte og opprettholder leverhomeostase via matricellulære signaler. Leverfibrose skyldes en ubalanse i den dynamiske ECM-remodelleringsprosessen og er preget av overdreven akkumulering av strukturelle elementer og tilhørende endringer i glykosaminoglykaner. Det typiske fibrosemønsteret til NASH kalles “kyllingeting”, som vanligvis består av sone 3 perisinusoidal / pericellulær fibrose, basert på funksjoner observert av Massons trikrome flekk og Picrosirius Red flekker. Imidlertid kan disse tradisjonelle tynne todimensjonale (2D) vevslysbildebaserte bildebehandlingsteknikkene ikke demonstrere de detaljerte tredimensjonale (3D) ECM-strukturelle endringene, noe som begrenser forståelsen av den dynamiske ECM-remodelleringen i leverfibrose.
Det nåværende arbeidet optimaliserte en rask og effektiv protokoll for å avbilde den opprinnelige ECM-strukturen i leveren via decellularisering for å løse de ovennevnte utfordringene. Mus ble matet enten med chow eller fastfood diett i 14 uker. Decellularisering ble utført etter in situ portveneperfusjon, og tofotonmikroskopiteknikkene ble anvendt til å avbilde og analysere forandringer i native ECM. 3D-bildene av normal- og NASH-lever ble rekonstituert og analysert. Å utføre in situ perfusjonsdecellularisering og analysere stillaset ved to-foton mikroskopi ga en praktisk og pålitelig plattform for å visualisere den dynamiske ECM-remodelleringen i leveren.
Ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD) er den vanligste leversykdommen, som påvirker 20% -25% av den voksne befolkningen. 25% av NAFLD-pasientene utvikler seg til ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH), hvor risikoen for skrumplever, leversvikt og hepatocellulært karsinom øker1. I de neste 20 årene er det anslått at NASH vil stå for 2 millioner leverrelaterte dødsfall i USA2. Siden det ikke finnes godkjente behandlinger, er det et presserende behov for å tyde mekanismene som forårsaker leverfibrose hos NASH-pasienter og utvikle målrettet behandling3.
Den ekstracellulære matrisen (ECM) er et dynamisk, komplekst mikromiljø som utøver toveis kommunikasjon med celler for å regulere vevshomeostase4. Leveren ECM består av strukturelle elementer som proteoglykaner, kollagen, fibronektin, elastin og andre ikke-strukturelle proteiner (f.eks. olfactomedin og trombospondin) for å gi fysisk og strukturell støtte4.
Leverfibrose er en kronisk sårhelingsrespons på leverskade av ulike etiologier, inkludert NASH3. Det skyldes en ubalanse i den dynamiske ECM-matrisemodelleringsprosessen og er preget av overdreven strukturelle proteiner i den skadede leveren4. Fibrogenese avhenger av den dynamiske celle-cellekommunikasjonen mellom forskjellige levercelletyper. Hepatiske stellatceller (HSC), når de aktiveres, skiller seg ut i Smooth Muscle Alpha 2 Actin-uttrykkende, migrerende og prolifererende myofibroblastlignende celler og syntetiserer ECM-proteiner som en sårlukkende virkning. Aktiverte HSCs er de sentrale kollagenproduserende cellene i leveren1.
Den molekylære mekanismen for ECM-remodellering, mønstre av fibrose og deres forhold til cellulære hendelser er ikke klare. En bedre forståelse av den tredimensjonale (3D) ECM-strukturen er fortsatt nødvendig, selv om massespektrometriteknikker har bidratt til å analysere ECM-proteinsammensetning4. Tradisjonelt har Massons trichrome flekk, Picro Sirius Red flekker og andre harmoniske generasjon (SHG) avbildning blitt utført på todimensjonale (2D) tynne leverseksjoner. Det typiske fibrosemønsteret til NASH kalles “kyllingeting”, som strekker seg til sone 3 og er perisinusoidal / pericellulær fibrose 5,6. Imidlertid har det vært mangel på studier som fokuserer på 3D-strukturen til den opprinnelige leveren, spesielt de som ikke involverer vevsseksjonering. Robuste bildebehandlingsmetoder for å identifisere mønstre og karakteristika ved fibrose gjennom dynamisk ECM-remodellering ved leverfibrose vil styrke forståelsen av NASH-mekanismer betydelig og identifisere nye terapeutiske mål.
For å møte disse utfordringene ble en rask og effektiv protokoll optimalisert for å avbilde den opprinnelige lever-ECM via decellularisering7. Decellularisering av hele leveren er en tilnærming for å fjerne det hepatiske cellulære innholdet samtidig som det opprinnelige 3D ECM-nettverket opprettholdes gjennom vaskemiddelperfusjon. Mus ble matet enten chow eller fast-food diett (FFD) i 14 uker. Decellularisering ble utført etter in situ portveneperfusjon med mildt vaskemiddel og lave strømningshastigheter for å bevare trippelspiralformede og native fibrillære kollagenstrukturer. To-foton mikroskopi ble brukt for å analysere endringer i kollagenstrukturer i ECM. 3D-bildene av den opprinnelige ECM-strukturen i normal- og NASH-lever ble rekonstituert og analysert. Å utføre in situ perfusjonsdecellularisering og analysere stillaset ved to-foton mikroskopi gir en praktisk og rimelig plattform for å visualisere den dynamiske ECM-remodelleringen i leveren.
Den nåværende protokollen viser at decellularisering gjennom en lav strømningshastighet DOC in situ perfusjon bevarer de skjørbare trippelspiralformede og native fibrillære kollagenstrukturene, og gir en pålitelig og kostnadseffektiv plattform for å fange dynamisk ECM-remodellering i NASH leverfibrose. Selv om decellularisering ble utført i normale og fibrotiske lever før identifisering av ECM-komponenter eller generering av biologiske stillaser for cellekultur, har dynamikken i ECM-remodellering i leve…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Hyesuk Park for teknisk hjelp. Denne forskningen ble støttet av finansiering fra National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, til NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, til NJT). Vi takker Jon Mulholland og Kitty Lee fra Cell Sciences Imaging Facility i Beckman Center for teknisk assistanse med to-foton mikroskopiavbildning.
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |