3D-визуализация внеклеточного матрикса печени на мышиной модели неалкогольного стеатогепатита
Summary
Настоящий протокол оптимизирует методы перфузии/децеллюляризации печени in situ и двухфотонной микроскопии для создания надежной платформы для визуализации динамики ремоделирования внеклеточного матрикса (ECM) при неалкогольном стеатогепатите (НАСГ).
Abstract
Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является наиболее распространенным хроническим заболеванием печени в Соединенных Штатах, поражающим более 70 миллионов американцев. НАСГ может прогрессировать до фиброза и, в конечном итоге, до цирроза, значительного фактора риска гепатоцеллюлярной карциномы. Внеклеточный матрикс (ECM) обеспечивает структурную поддержку и поддерживает гомеостаз печени с помощью матрицеллюлярных сигналов. Фиброз печени возникает в результате дисбаланса в динамическом процессе ремоделирования ECM и характеризуется чрезмерным накоплением структурных элементов и связанными с этим изменениями гликозаминогликанов. Типичная картина фиброза НАСГ называется «куриной проволокой», которая обычно состоит из перисинусоидального / перицеллюлярного фиброза зоны 3, основанного на особенностях, наблюдаемых трихромным пятном Массона и красными пятнами Picrosirius. Тем не менее, эти традиционные методы визуализации на основе тонких двумерных (2D) тканевых слайдов не могут продемонстрировать подробные трехмерные (3D) структурные изменения ECM, что ограничивает понимание динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени.
Текущая работа оптимизировала быстрый и эффективный протокол для визуализации нативной структуры ECM в печени посредством децеллюляризации для решения вышеуказанных проблем. Мышей кормили либо чау-чау, либо фаст-фудом в течение 14 недель. Децеллюляризацию проводили после перфузии воротной вены in situ , а методы двухфотонной микроскопии применяли для визуализации и анализа изменений в нативной ECM. Были восстановлены и проанализированы 3D-изображения нормальной печени и печени с НАСГ. Выполнение перфузионной децеллюляризации in situ и анализ каркаса с помощью двухфотонной микроскопии обеспечили практичную и надежную платформу для визуализации динамического ремоделирования ECM в печени.
Introduction
Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является наиболее распространенным заболеванием печени, поражающим 20-25% взрослого населения. У 25% пациентов с НАЖБП прогрессирует до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), при котором повышается риск цирроза печени, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы1. По оценкам, в ближайшие 20 лет на долю НАСГ будет приходиться 2 миллиона смертей, связанных с печенью, в США2. Поскольку не существует утвержденных методов лечения, существует острая необходимость в расшифровке механизмов, вызывающих фиброз печени у пациентов с НАСГ, и разработке целенаправленного лечения3.
Внеклеточный матрикс (ECM) представляет собой динамическое сложное микроокружение, которое осуществляет двунаправленную связь с клетками для регулирования гомеостазатканей 4. ECM печени состоит из структурных элементов, таких как протеогликаны, коллагены, фибронектин, эластин и другие неструктурные белки (например, ольфактомедин и тромбоспондин) для обеспечения физической и структурной поддержки4.
Фиброз печени является хронической ранозаживляющей реакцией на поражение печени различной этиологии, включая НАСГ3. Он возникает в результате дисбаланса в процессе динамического ремоделирования матрицы ECM и характеризуется чрезмерным количеством структурных белков в поврежденной печени4. Фиброгенез зависит от динамической межклеточной коммуникации между различными типами клеток печени. Звездчатые клетки печени (ГСК) при активации дифференцируются в гладкомышечные альфа-2-актин-экспрессирующие, мигрирующие и пролиферирующие миофибробластоподобные клетки и синтезируют белки ECM в качестве закрывающего рану действия. Активированные ГСК являются центральными клетками, продуцирующими коллаген в печени1.
Молекулярный механизм ремоделирования ECM, паттерны фиброза и их связь с клеточными событиями не ясны. По-прежнему необходимо лучше понять трехмерную (3D) структуру ECM, даже несмотря на то, что методы масс-спектрометрии помогли проанализировать состав белкаECM 4. Традиционно трихромное окрашивание Массона, красители Picro Sirius Red и визуализация генерации второй гармоники (SHG) выполнялись на двумерных (2D) тонких срезах печени. Типичная картина фиброза НАСГ называется «куриной проволокой», которая распространяется на зону 3 и представляет собой перисинусоидальный/перицеллюлярный фиброз 5,6. Тем не менее, не хватало исследований, посвященных 3D-структуре нативной печени, особенно тех, которые не связаны с разделением тканей. Надежные подходы к визуализации для выявления закономерностей и характеристик фиброза во время динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени значительно укрепит понимание механизмов НАСГ и выявят новые терапевтические мишени.
Чтобы решить эти проблемы, был оптимизирован быстрый и эффективный протокол для визуализации ECM нативной печени с помощью децеллюляризации7. Децеллюляризация всей печени — это подход к удалению клеточного содержимого печени при сохранении нативной сети 3D ECM за счет перфузии детергента. Мышей кормили либо чау-чау, либо диетой быстрого питания (FFD) в течение 14 недель. Децеллюляризацию проводили после перфузии воротной вены in situ мягким детергентом и низкой скоростью потока для сохранения тройных спиральных и нативных фибриллярных коллагеновых структур. Двухфотонная микроскопия применялась для анализа изменений коллагеновых структур в ECM. Были восстановлены и проанализированы 3D-изображения нативной структуры ECM в нормальной печени и печени с НАСГ. Выполнение перфузионной децеллюляризации in situ и анализ каркаса с помощью двухфотонной микроскопии обеспечивает практичную и доступную платформу для визуализации динамического ремоделирования ECM в печени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол показывает, что децеллюляризация с помощью перфузии DOC in situ с низкой скоростью потока сохраняет хрупкие структуры тройной спирали и нативного фибриллярного коллагена, обеспечивая надежную и экономичную платформу для динамического ремоделирования ECM при фибро?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим Hyesuk Park за техническую помощь. Это исследование было поддержано финансированием Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, в NJT), Национального института старения (NIA), NIH (1R01AG060726, в NJT). Мы выражаем благодарность Джону Малхолланду (Jon Mulholland) и Китти Ли (Kitty Lee) из Центра клеточных наук (Cell Sciences Imaging Facility) Центра Бекмана (Beckman Center) за техническую помощь в проведении двухфотонной микроскопии.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
Referências
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome – looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R. The matrix in cancer. Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
