Det nuvarande protokollet optimerar leverns in situ-perfusion /decellularisering och tvåfotonmikroskopimetoder för att etablera en tillförlitlig plattform för att visualisera dynamiken i extracellulär matris (ECM) remodellering under alkoholfri steatohepatit (NASH).
Icke-alkoholisk steatohepatit (NASH) är den vanligaste kroniska leversjukdomen i USA och påverkar mer än 70 miljoner amerikaner. NASH kan utvecklas till fibros och så småningom till cirros, en signifikant riskfaktor för hepatocellulärt karcinom. Den extracellulära matrisen (ECM) ger strukturellt stöd och upprätthåller leverhomeostas via matricellulära signaler. Leverfibros är resultatet av en obalans i den dynamiska ECM-remodelleringsprocessen och kännetecknas av överdriven ackumulering av strukturella element och associerade förändringar i glykosaminoglykaner. Det typiska fibrosmönstret för NASH kallas “kycklingtråd”, som vanligtvis består av zon 3 perisinusformad / pericellulär fibros, baserat på funktioner som observerats av Massons trikroma fläck och Picrosirius röda fläckar. Dessa traditionella tunna tvådimensionella (2D) vävnadsglidbaserade avbildningstekniker kan emellertid inte visa de detaljerade tredimensionella (3D) ECM-strukturella förändringarna, vilket begränsar förståelsen för den dynamiska ECM-ombyggnaden vid leverfibros.
Det nuvarande arbetet optimerade ett snabbt och effektivt protokoll för att avbilda den ursprungliga ECM-strukturen i levern via decellularisering för att ta itu med ovanstående utmaningar. Möss matades antingen med chow eller snabbmat diet i 14 veckor. Decellularisering utfördes efter in situ portalvenperfusion, och tvåfotonmikroskopiteknikerna tillämpades för att avbilda och analysera förändringar i den ursprungliga ECM. 3D-bilderna av normal- och NASH-lever rekonstituerades och analyserades. Att utföra in situ perfusionsdecellularisering och analysera ställningen med tvåfotonmikroskopi gav en praktisk och pålitlig plattform för att visualisera den dynamiska ECM-ombyggnaden i levern.
Icke-alkoholhaltig fettleversjukdom (NAFLD) är den vanligaste leversjukdomen och drabbar 20% -25% av den vuxna befolkningen. 25% av NAFLD-patienterna utvecklas till alkoholfri steatohepatit (NASH), där risken för cirros, leversvikt och hepatocellulärt karcinom ökar1. Under de kommande 20 åren beräknas NASH stå för 2 miljoner leverrelaterade dödsfall i USA2. Eftersom det inte finns några godkända behandlingar finns det ett akut behov av att dechiffrera de mekanismer som orsakar leverfibros hos NASH-patienter och utveckla riktad behandling3.
Den extracellulära matrisen (ECM) är en dynamisk, komplex mikromiljö som utövar dubbelriktad kommunikation med celler för att reglera vävnadshomeostas4. Leverns ECM består av strukturella element såsom proteoglykaner, kollagener, fibronektin, elastin och andra icke-strukturella proteiner (t.ex. olfactomedin och trombospondin) för att ge fysiskt och strukturellt stöd4.
Leverfibros är ett kroniskt sårläkningssvar på leverskador av olika etiologier, inklusive NASH3. Det beror på en obalans i den dynamiska ECM-matrisremodelleringsprocessen och kännetecknas av överdrivna strukturella proteiner i den skadade levern4. Fibrogenes beror på den dynamiska cell-cellkommunikationen mellan olika levercelltyper. Hepatiska stellatceller (HSC), när de aktiveras, differentieras till glatt muskulatur alfa 2 Actin-uttryckande, migrerande och prolifererande myofibroblastliknande celler och syntetiserar ECM-proteiner som en sårstängande verkan. Aktiverade HSC är de centrala kollagenproducerande cellerna i levern1.
Den molekylära mekanismen för ECM-remodellering, fibrosmönster och deras förhållande till cellulära händelser är inte klarlagda. En bättre förståelse av den tredimensionella (3D) ECM-strukturen behövs fortfarande, även om masspektrometritekniker har hjälpt till att analysera ECM-proteinsammansättning4. Traditionellt har Massons trikroma fläck, Picro Sirius Red-fläckar och andra harmoniska generationens (SHG) avbildning utförts på tvådimensionella (2D) tunna leversektioner. Det typiska fibrosmönstret för NASH kallas “kycklingtråd”, som sträcker sig till zon 3 och är perisinusformad / pericellulär fibros 5,6. Det har dock saknats studier som fokuserar på 3D-strukturen hos den inhemska levern, särskilt de som inte involverar vävnadssnitt. Robusta avbildningsmetoder för att identifiera mönster och egenskaper hos fibros under dynamisk ECM-remodellering vid leverfibros skulle avsevärt stärka förståelsen för NASH-mekanismer och identifiera nya terapeutiska mål.
För att ta itu med dessa utmaningar optimerades ett snabbt och effektivt protokoll för att avbilda den ursprungliga lever-ECM via decellularisering7. Helleverdecellularisering är ett tillvägagångssätt för att avlägsna det hepatiska cellulära innehållet samtidigt som det ursprungliga 3D ECM-nätverket upprätthålls genom tvättmedelsperfusion. Möss matades antingen chow eller snabbmatdiet (FFD) i 14 veckor. Decellularisering utfördes efter in situ portalvenperfusion med milt rengöringsmedel och låga flödeshastigheter för att bevara trippelspiralformade och inhemska fibrillära kollagenstrukturer. Tvåfotonmikroskopi användes för att analysera förändringar i kollagenstrukturer i ECM. 3D-bilderna av den ursprungliga ECM-strukturen i normala och NASH-lever rekonstituerades och analyserades. Att utföra in situ perfusionsdecellularisering och analysera ställningen med tvåfotonmikroskopi ger en praktisk och prisvärd plattform för att visualisera den dynamiska ECM-ombyggnaden i levern.
Det nuvarande protokollet visar att decellularisering genom en låg flödeshastighet DOC in situ perfusion bevarar de frangible trippelspiralformade och inhemska fibrillära kollagenstrukturerna, vilket ger en pålitlig och kostnadseffektiv plattform för att fånga dynamisk ECM-remodellering i NASH-leverfibros. Även om decellularisering utfördes i normala och fibrotiska lever innan ECM-komponenter identifierades eller biologiska byggnadsställningar genererades för cellodling, har dynamiken i ECM-remodelleri…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Hyesuk Park för den tekniska hjälpen. Denna forskning stöddes av finansiering från National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, till NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, till NJT). Vi tackar Jon Mulholland och Kitty Lee från Cell Sciences Imaging Facility i Beckman Center för teknisk hjälp med tvåfotonmikroskopiavbildning.
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |