原发性患者特异性主动脉平滑肌细胞的分离和体外半定量实时收缩测量
Summary
本文介绍了一种基于外植体培养的方法，用于分离和培养原代患者特异性人主动脉平滑肌细胞和真皮成纤维细胞。此外，还提出了一种用于测量细胞收缩和后续分析的新方法，可用于研究这些细胞中患者特异性差异。
Abstract
平滑肌细胞（SMC）是主动脉介质中的主要细胞类型。它们的收缩机制对于主动脉中力的传递很重要，并调节血管收缩和血管舒张。编码SMC收缩器官蛋白的基因突变与主动脉疾病有关，例如胸主动脉瘤。 在体外 测量SMC收缩具有挑战性，特别是以高通量方式，这对于筛查患者材料至关重要。当前可用的方法不适合此目的。本文提出了一种基于电电池基板阻抗传感（ECIS）的新方法。首先，描述了一种外植体方案，用于从主动脉活检和患者特异性人原发性真皮成纤维细胞中分离出患者特异性人原发性SMC，以研究主动脉瘤。接下来，详细描述了一种新的收缩方法来测量这些细胞的收缩反应，包括随后的分析和比较不同组的建议。该方法可用于在转化（心血管）研究以及患者和药物筛选研究的背景下研究贴壁细胞的收缩。
Introduction
平滑肌细胞（SMC）是主动脉内侧层中的主要细胞类型，是主动脉最厚的一层。在壁内，它们是径向的，除其他功能外，还参与血管收缩和血管舒张1。SMC收缩机制通过与细胞外基质2的功能连接参与主动脉中力的传递。编码SMC收缩器官蛋白质的基因突变，如平滑肌肌球蛋白重链（MYH11）和平滑肌肌动蛋白（ACTA2），与家族性胸主动脉瘤病例有关，强调了SMC收缩在维持主动脉结构和功能完整性方面的相关性1，2.此外，TGFβ信号通路中的突变也与主动脉瘤有关，它们在主动脉瘤病理生理学中的作用也可以在皮肤成纤维细胞中研究3。
体外SMC收缩的高通量测量具有挑战性。由于SMC收缩力不能在人体体内测量，因此在人体细胞上进行体外测定是一种可行的替代方案。此外，动物模型中的腹主动脉瘤（AAA）发展要么是由弹性蛋白酶灌注等化学诱导的，要么是由特定突变引起的。因此，动物数据不能与人类的AAA发展相提并论，后者大多具有多因素原因，例如吸烟，年龄和/或动脉粥样硬化。体外迄今为止，SMC收缩力主要通过牵引力显微镜4，5，荧光细胞内钙通量6的定量和胶原皱纹测定7来测定。虽然牵引力显微镜提供了对单个细胞产生的力的宝贵数字洞察力，但由于复杂的数学数据处理和一次分析一个细胞，它不适合高通量筛选，这意味着测量每个供体的代表性细胞数量非常耗时。Fura-2染料和胶原起皱测定允许表面上确定收缩，并且不能给出精确的数值输出，使它们不太适合区分患者特异性差异。通过优化一种测量体外SMC收缩的新方法，首次证明了腹主动脉瘤患者主动脉瘤患者主动脉瘤细胞中SMC收缩受损8。这是通过重新利用电电池基板阻抗传感（ECIS）方法完成的。ECIS是一种实时的中等通量测定法，用于定量贴壁细胞行为和收缩9，10，11，例如SMC生长和伤口愈合和迁移测定中的行为12，13，14。确切的方法在协议部分进行了描述。以这种优化的方式，ECIS也可用于研究成纤维细胞收缩，因为它们的大小和形态相似。
本文的目的是逐步描述使用ECIS8测量体外SMC收缩的方法，并比较对照组和患者SMC之间的收缩。首先，解释了原代SMC从对照和患者主动脉活检中的分离和培养，可用于收缩测量。其次，描述了收缩测量和分析，以及SMC标志物表达的验证。此外，本文描述了分离患者特异性真皮成纤维细胞的方法，其收缩可以使用相同的方法测量。这些细胞可用于专注于主动脉瘤或其他心血管病理学的患者特异性研究15，或使用转分化方案的预后研究，其允许在动脉瘤手术前进行收缩测量16。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文提出了一种基于阻抗和表面占用变化 的体外测量SMC收缩的方法。首先，描述了患者特异性原代人类SMC和皮肤成纤维细胞的分离，培养和扩增，然后描述了如何使用它们进行收缩测量。
该研究的局限性与通过外植体方案获得细胞有关。从活检中增殖的细胞可能具有与 体内原始组织不同的性质。此外，这里介绍的外植体方案并不具有创新性，但包括用于提供?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Tara van Merrienboer，Albert van Wijk，Jolanda van der Velden，Jan D. Blankensteijn，Lan Tran，Peter L. Hordijk，PAREL-AAA团队以及阿姆斯特丹UMC，Zaans Medisch Centrum和Dijklander医院的所有血管外科医生为这项研究提供了材料和支持。
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Referências
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