Este artigo descreve um método baseado em cultura explant para o isolamento e cultivo de células musculares humanas aórticas humanas primárias e específicas do paciente e fibroblastos dérmicos. Além disso, é apresentado um novo método para medir a contração celular e a análise subsequente, que pode ser usado para estudar diferenças específicas do paciente nessas células.
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Artigo de método
Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células musculares lisas (SMCs) são o tipo de célula predominante na mídia aórtica. Sua máquina de fundição é importante para a transmissão da força na aorta e regula a vasoconstrição e vasodilatação. Mutações em genes codificados para as proteínas do aparelho contítil do SMC estão associadas a doenças aórticas, como aneurismas de aoórtico torácico. Medir a contração de SMC in vitro é desafiador, especialmente de forma de alto rendimento, o que é essencial para a triagem do material do paciente. Atualmente, os métodos disponíveis não são adequados para este fim. Este artigo apresenta um novo método baseado no sensor de impedância de células elétricas (ECIS). Primeiro, um protocolo de explant é descrito para isolar os SMCs primários humanos específicos do paciente de biópsias aórticas e fibroblastos dérmicos humanos específicos do paciente para o estudo de aneurismas àórtica. Em seguida, é dada uma descrição detalhada de um novo método de contração para medir a resposta contratil dessas células, incluindo a análise subsequente e sugestão para comparar diferentes grupos. Este método pode ser utilizado para estudar a contração de células aderentes no contexto de estudos translacionais (cardiovasculares) e estudos de triagem de pacientes e medicamentos.
Introdução
As células musculares lisas (SMCs) são o tipo de célula predominante na camada medial aórtica, a camada mais grossa da aorta. Dentro da parede, eles são radialmente orientados e estão envolvidos, entre outras funções, vasoconstrição e vasodilatação1. O maquinário contratado da SMC está envolvido na transmissão de força na aorta através do vínculo funcional com a matriz extracelular2. Mutações em genes codificados para as proteínas do aparelho contítil SMC, como a cadeia pesada de miosina muscular lisa (MYH11) e a actina muscular lisa (ACTA2), têm sido relacionadas a casos de aneurismas aórticos torácico....
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Protocolo
NOTA: Biópsias aórticas foram obtidas durante reparo de aneurisma aberto em Amsterdam University Medical Centers, VU University Medical center, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam e Dijklander hospital, Hoorn, holanda. O tecido aórtico de controle foi obtido a partir do pedaço da aorta ligado à artéria renal colhida para transplantes renais. Apenas pacientes acima de 18 anos foram incluídos, e todos os pacientes deram seu consentimento informado para participar do estudo. Todo o material foi coletado de acordo com as normas da Declaração de Helsinque da WMA e as diretrizes institucionais do Comitê de Ética Médica do Centro Médico da VU. Todos os experimentos e p....
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Resultados
Para testar a reprodutibilidade deste método, o método foi validado apenas utilizando SMCs de controle. Para determinar a reprodutibilidade da medição interexperimental, duas medidas independentes de todas as linhas de controle e células do paciente foram traçadas como um enredo Bland-Altman (Figura 3B). O enredo demonstrou que este método não mostra variabilidade fora do intervalo de confiança, exceto por uma linha celular outlier. Além disso, esses resultados demonstraram que dois poços se.......
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Discussão
Este artigo apresenta um método para medir a contração do SMC in vitro, com base nas mudanças de impedância e ocupação superficial. Em primeiro lugar, descreve-se o isolamento, a culminação e a expansão de SMCs humanos primários específicos do paciente e fibroblastos de pele, seguidos de como usá-los para medidas de contração.
Uma limitação do estudo está relacionada à obtenção das células através de um protocolo de explant. As células que se proliferam da biópsia podem ter proprieda.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Gostaríamos de reconhecer com gratidão Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, a equipe DO PAREL-AAA, e todos os cirurgiões vasculares do UmC de Amsterdã, Zaans Medisch Centrum e Dijklander por fornecerem materiais e apoio para este estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Matriz de 96 poços | Biofísica Aplicada | 96W10idf PET | Array usado para medir a contração na configuração do ECIS |
| Custodiol | Dr. Franz Hö hler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solução usada para transferir tecidos da sala de cirurgia para o laboratório |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | 472301 | Solução usada para diluir a ionomicina |
| Soro fetal bovino | Gibco | 26140079 | Além do meio de cultura de células |
| Mistura de nutrientes F-10 da Hama | Gibco | 11550043 | Meio usado para cultura de fibroblastos |
| da peleMeio Basal de Célula de Músculo Liso Vascular Humano (anteriormente ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Meio usado para cultivar células musculares lisas |
| Condessa Invitrogen II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Contador de células automatizado |
| Sal de cálcio de ionomicina de Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Composto usado para estimulação de contração |
| NaCl 0,9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solução usada para transferir tecido da sala de cirurgia para o laboratório |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140122 | Antibióticos usados para meio de cultura de células |
| Fospata tamponada salina | Gibco | 10010023 | Usado para lavar células |
| Kit Miniprep de RNA rápido | Kit Zymo Research | R1055 | usado para isolamento |
| de RNASuplemento de Crescimento de Músculo Liso (SMGS) | Gibco | S00725 | Suplemento que é adicionado ao meio de cultura de células de músculo liso |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | usado para síntese de cDNA |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher | Scientific 4309155 Reagent para qPCR | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 15400-054 | Usado para tripsinizar |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | Instrumento ECIS usado para medições de contração |
Referências
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al.
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Reimpressões e permissões
