Isolement des cellules musculaires lisses aortiques primaires spécifiques au patient et mesures semi-quantitatives de contraction en temps réel in vitro
Summary
Cet article décrit une méthode basée sur la culture d’explants pour l’isolement et la culture de cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires spécifiques au patient et de fibroblastes dermiques. En outre, une nouvelle méthode est présentée pour mesurer la contraction cellulaire et l’analyse ultérieure, qui peut être utilisée pour étudier les différences spécifiques au patient dans ces cellules.
Abstract
Les cellules musculaires lisses (SMC) sont le type de cellule prédominant dans le milieu aortique. Leur machinerie contractile est importante pour la transmission de la force dans l’aorte et régule la vasoconstriction et la vasodilatation. Les mutations dans les gènes codant pour les protéines de l’appareil contractile SMC sont associées à des maladies de l’aorte, telles que les anévrismes de l’aorte thoracique. Mesurer la contraction de la SMC in vitro est difficile, en particulier de manière à haut débit, ce qui est essentiel pour le dépistage du matériel du patient. Les méthodes actuellement disponibles ne conviennent pas à cette fin. Cet article présente une nouvelle méthode basée sur la détection d’impédance de substrat de cellule électrique (ECIS). Tout d’abord, un protocole d’explantation est décrit pour isoler les SMC primaires humains spécifiques au patient à partir de biopsies aortiques et de fibroblastes dermiques primaires humains spécifiques au patient pour l’étude des anévrismes de l’aorte. Ensuite, une description détaillée d’une nouvelle méthode de contraction est donnée pour mesurer la réponse contractile de ces cellules, y compris l’analyse ultérieure et la suggestion de comparer différents groupes. Cette méthode peut être utilisée pour étudier la contraction des cellules adhérentes dans le cadre d’études translationnelles (cardiovasculaires) et d’études de dépistage de patients et de médicaments.
Introduction
Les cellules musculaires lisses (SMC) sont le type de cellule prédominant dans la couche médiale aortique, la couche la plus épaisse de l’aorte. À l’intérieur du mur, ils sont orientés radialement et sont impliqués, entre autres fonctions, dans la vasoconstriction et la vasodilatation1. La machine contractile SMC est impliquée dans la transmission de la force dans l’aorte à travers le lien fonctionnel avec la matrice extracellulaire2. Des mutations dans les gènes codant pour les protéines de l’appareil contractile SMC, telles que la chaîne lourde de la myosine du muscle lisse (MYH11) et l’actine du muscle lisse (ACTA2), ont été liées à des cas d’anévrismes de l’aorte thoracique familiale, soulignant la pertinence de la contraction du SMC dans le maintien de l’intégrité structurelle et fonctionnelle de l’aorte 1,2 . En outre, des mutations dans la voie de signalisation TGFβ sont également associées à des anévrismes de l’aorte, et leurs effets sur la physiopathologie de l’anévrisme de l’aorte peuvent également être étudiés dans les fibroblastes cutanés3.
La mesure à haut débit de la contraction SMC in vitro est un défi. Comme la contractilité SMC ne peut pas être mesurée in vivo chez l’homme, les essais in vitro sur des cellules humaines présentent une alternative réalisable. De plus, le développement de l’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) dans les modèles animaux est soit induit chimiquement par, par exemple, la perfusion d’élastase, soit causé par une mutation spécifique. Par conséquent, les données animales ne sont pas comparables au développement de l’AAA chez l’homme, qui a principalement une cause multifactorielle, comme le tabagisme, l’âge et / ou l’athérosclérose. In vitro Jusqu’à présent, la contractilité du SMC a été principalement mesurée par microscopie à force de traction 4,5, quantification des flux de calcium intracellulaire de fluorescence Fura-26 et essais de rides au collagène7. Bien que la microscopie à force de traction fournisse un aperçu numérique inestimable des forces générées par une seule cellule, elle ne convient pas au criblage à haut débit en raison du traitement complexe des données mathématiques et de l’analyse d’une cellule à la fois, ce qui signifie qu’il est très long de mesurer un nombre représentatif de cellules par donneur. Les tests de teinture Fura-2 et de rides au collagène permettent la détermination superficielle de la contraction et ne donnent pas une sortie numérique précise, ce qui les rend moins adaptés à la discrimination des différences spécifiques au patient. Une altération de la contraction de la SMC dans les cellules dérivées de l’aorte des patients atteints d’anévrisme de l’aorte abdominale a été démontrée pour la première fois en optimisant une nouvelle méthode de mesure de la contraction de la SMC in vitro8. Cela a été fait en réorientant la méthode de détection d’impédance de la cellule électrique et du substrat (ECIS). ECIS est un test en temps réel à débit moyen pour la quantification du comportement et de la contraction des cellules adhérentes 9,10,11 tels que la croissance et le comportement SMC dans les tests de cicatrisation et de migration des plaies 12,13,14. La méthode exacte est décrite dans la section protocole. De cette manière optimisée, l’ECIS peut également être utilisé pour étudier la contraction des fibroblastes en raison de leur taille et de leur morphologie similaires.
L’objectif de cet article est de fournir une description par étapes de la méthode de mesure de la contraction SMC in vitro à l’aide d’ECIS8 et de comparer la contraction entre les SMC témoins et patients. Tout d’abord, l’isolement et la culture des SMC primaires à partir de biopsies aortiques de contrôle et de patients sont expliqués, ce qui peut être utilisé pour la mesure de la contraction. Deuxièmement, les mesures et l’analyse de la contraction, ainsi que la vérification de l’expression des marqueurs SMC, sont décrites. En outre, cet article décrit la méthode d’isolement des fibroblastes dermiques spécifiques au patient dont la contraction peut être mesurée à l’aide de la même méthodologie. Ces cellules peuvent être utilisées pour des études spécifiques au patient axées sur l’anévrisme de l’aorte ou d’autres pathologies cardiovasculaires15 ou des études pronostiques utilisant un protocole de transdifférenciation qui permet la mesure de la contraction avant la chirurgie de l’anévrisme16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente une méthode pour mesurer la contraction de la SMC in vitro, basée sur les changements d’impédance et d’occupation de surface. Tout d’abord, l’isolement, la culture et l’expansion des SMC et des fibroblastes cutanés humains primaires spécifiques au patient sont décrits, suivis de la façon de les utiliser pour les mesures de contraction.
Une limitation de l’étude est liée à l’obtention des cellules par le biais d’un protocole d’explanta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, l’équipe PAREL-AAA et tous les chirurgiens vasculaires de l’UMC d’Amsterdam, du Zaans Medisch Centrum et de l’hôpital Dijklander pour avoir fourni du matériel et du soutien à cette étude.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
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