Isolamento delle cellule muscolari lisce aortiche primarie specifiche del paziente e misurazioni semiquantitative di contrazione in tempo reale in vitro
Summary
Questo documento descrive un metodo basato su colture di espianto per l’isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche umane primarie e specifiche per il paziente e fibroblasti dermici. Inoltre, viene presentato un nuovo metodo per misurare la contrazione cellulare e la successiva analisi, che può essere utilizzato per studiare le differenze specifiche del paziente in queste cellule.
Abstract
Le cellule muscolari lisce (SMC) sono il tipo di cellula predominante nel mezzo aortico. Il loro meccanismo contrattile è importante per la trasmissione della forza nell’aorta e regola la vasocostrizione e la vasodilatazione. Le mutazioni nei geni che codificano per le proteine dell’apparato contrattile SMC sono associate a malattie aortiche, come gli aneurismi dell’aorta toracica. Misurare la contrazione SMC in vitro è impegnativo, specialmente in modo ad alta produttività, che è essenziale per lo screening del materiale del paziente. I metodi attualmente disponibili non sono adatti a questo scopo. Questo documento presenta un nuovo metodo basato sul rilevamento dell’impedenza del substrato elettrico della cellula (ECIS). In primo luogo, viene descritto un protocollo di espianto per isolare le SMC primarie umane specifiche del paziente dalle biopsie aortiche e dai fibroblasti dermici primari umani specifici del paziente per lo studio degli aneurismi aortici. Successivamente, viene fornita una descrizione dettagliata di un nuovo metodo di contrazione per misurare la risposta contrattile di queste cellule, compresa la successiva analisi e il suggerimento per confrontare diversi gruppi. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la contrazione delle cellule aderenti nel contesto di studi traslazionali (cardiovascolari) e studi di screening di pazienti e farmaci.
Introduction
Le cellule muscolari lisce (SMC) sono il tipo di cellula predominante nello strato mediale aortico, lo strato più spesso dell’aorta. All’interno della parete, sono orientati radialmente e sono coinvolti, tra le altre funzioni, nella vasocostrizione e nella vasodilatazione1. Il macchinario contrattile SMC è coinvolto nella trasmissione della forza nell’aorta attraverso il collegamento funzionale con la matrice extracellulare2. Mutazioni in geni che codificano per le proteine dell’apparato contrattile SMC, come la catena pesante della miosina muscolare liscia (MYH11) e l’actina della muscolatura liscia (ACTA2), sono state correlate a casi di aneurismi dell’aorta toracica familiare, sottolineando la rilevanza della contrazione della SMC nel mantenimento dell’integrità strutturale e funzionale dell’aorta 1,2 . Inoltre, le mutazioni nella via di segnalazione del TGFβ sono anche associate agli aneurismi aortici e i loro effetti nella fisiopatologia dell’aneurisma aortico possono essere studiati anche nei fibroblasti cutanei3.
La misurazione ad alto rendimento della contrazione SMC in vitro è impegnativa. Poiché la contrattilità SMC non può essere misurata in vivo nell’uomo, i saggi in vitro su cellule umane presentano un’alternativa fattibile. Inoltre, lo sviluppo dell’aneurisma dell’aorta addominale (AAA) in modelli animali è indotto chimicamente, ad esempio, dalla perfusione di elastasi o causato da una mutazione specifica. Pertanto, i dati sugli animali non sono paragonabili allo sviluppo di AAA nell’uomo, che per lo più ha una causa multifattoriale, come il fumo, l’età e / o l’aterosclerosi. In vitro La contrattilità SMC è stata finora misurata principalmente mediante microscopia a forzadi trazione 4,5, quantificazione dei flussi di calcio intracellulare a fluorescenza Fura-26 e saggi di rughe di collagene7. Mentre la microscopia con forza di trazione fornisce preziose informazioni numeriche sulle forze generate da una singola cellula, non è adatta per lo screening ad alto rendimento a causa della complessa elaborazione dei dati matematici e dell’analisi di una cellula alla volta, il che significa che è molto dispendioso in termini di tempo misurare un numero rappresentativo di cellule per donatore. I saggi di tintura fura-2 e di rughe di collagene consentono la determinazione superficiale della contrazione e non danno un risultato numerico preciso, rendendoli meno adatti a discriminare le differenze specifiche del paziente. La compromissione della contrazione della SMC nelle cellule derivate dall’aorta dei pazienti con aneurisma dell’aorta addominale è stata dimostrata per la prima volta ottimizzando un nuovo metodo per misurare la contrazione della SMC in vitro8. Ciò è stato fatto riutilizzando il metodo di rilevamento dell’impedenza del substrato elettrico della cella (ECIS). ECIS è un test in tempo reale a medio rendimento per la quantificazione del comportamento e della contrazione delle cellule aderenti 9,10,11 come la crescita e il comportamento SMC nei saggi di guarigione e migrazione delle ferite 12,13,14. Il metodo esatto è descritto nella sezione del protocollo. In questo modo ottimizzato, l’ECIS può anche essere utilizzato per studiare la contrazione dei fibroblasti a causa delle loro dimensioni e morfologia simili.
Lo scopo di questo documento è quello di fornire una descrizione graduale del metodo per misurare la contrazione SMC in vitro utilizzando ECIS8 e confrontando la contrazione tra controllo e SMC paziente. In primo luogo, viene spiegato l’isolamento e la coltura delle SMC primarie dalle biopsie aortiche di controllo e del paziente, che possono essere utilizzate per la misurazione della contrazione. In secondo luogo, vengono descritte le misurazioni e l’analisi della contrazione, insieme alla verifica dell’espressione del marcatore SMC. Inoltre, questo documento descrive il metodo per l’isolamento dei fibroblasti dermici specifici del paziente la cui contrazione può essere misurata utilizzando la stessa metodologia. Queste cellule possono essere utilizzate per studi specifici del paziente incentrati sull’aneurisma aortico o altre patologie cardiovascolari15 o studi prognostici utilizzando un protocollo di transdifferenziazione che consente la misurazione della contrazione prima dell’intervento chirurgico all’aneurisma16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento presenta un metodo per misurare la contrazione SMC in vitro, basato sui cambiamenti nell’impedenza e nell’occupazione della superficie. In primo luogo, viene descritto l’isolamento, la coltura e l’espansione delle SMC umane primarie specifiche del paziente e dei fibroblasti cutanei, seguite da come usarle per le misurazioni della contrazione.
Una limitazione dello studio è legata all’ottenimento delle cellule attraverso un protocollo di espianto. Le cellule che prol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, il team PAREL-AAA e tutti i chirurghi vascolari dell’ospedale UMC di Amsterdam, Zaans Medisch Centrum e Dijklander per aver fornito materiali e supporto per questo studio.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Referências
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