일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리
Summary
이 논문은 원발성, 환자 특이적 인간 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포의 분리 및 배양을 위한 explant 배양 기반 방법을 기술한다. 또한, 세포 수축 및 후속 분석을 측정하기위한 새로운 방법이 제시되며, 이는 이들 세포의 환자 별 차이를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
Abstract
평활근 세포 (SMCs)는 대동맥 매질에서 우세한 세포 유형이다. 그들의 수축 기계는 대동맥에서 힘의 전달에 중요하며 혈관 수축과 혈관 확장을 조절합니다. SMC 수축 장치 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 대동맥류, 예컨대 흉부 대동맥류와 관련이 있다. 시험관 내에서 SMC 수축을 측정하는 것은 특히 환자 물질 스크리닝에 필수적인 높은 처리량 방식으로 도전적입니다. 현재 사용 가능한 방법은 이러한 목적에 적합하지 않습니다. 이 논문은 전기 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS)에 기반한 새로운 방법을 제시합니다. 먼저, 대동맥류의 연구를 위해 대동맥류 연구를 위해 환자 특이적 인간 원발성 SMCs를 대동맥류 생검 및 환자 특이적 인간 원발성 진피 섬유아세포로부터 분리하기 위한 explant 프로토콜이 기술된다. 다음으로, 이들 세포의 수축 반응을 측정하기 위한 새로운 수축 방법에 대한 상세한 설명이 주어지며, 상이한 집단을 비교하기 위한 후속 분석 및 제안을 포함한다. 이 방법은 번역 (심혈관) 연구 및 환자 및 약물 스크리닝 연구의 맥락에서 부착성 세포의 수축을 연구하는데 사용될 수 있다.
Introduction
평활근 세포 (SMCs)는 대동맥의 가장 두꺼운 층인 대동맥 내측 층에서 우세한 세포 유형이다. 벽 내에서, 그들은 방사상 지향적이며 다른 기능들 중에서도 혈관 수축 및 혈관 확장에 관여합니다1. SMC 수축 기계는 세포외 매트릭스(2)와의 기능적 링크를 통해 대동맥에서의 힘의 전달에 관여한다. 평활근 미오신 중쇄 (MYH11) 및 평활근 액틴 (ACTA2)과 같은 SMC 수축 장치의 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이는 가족 흉부 대동맥류의 경우와 관련이 있으며, 대동맥의 구조적 및 기능적 완전성을 유지하는 데 SMC 수축의 관련성을 강조합니다 1,2 . 또한, TGFβ 신호전달 경로의 돌연변이는 대동맥류와도 관련이 있으며, 대동맥류에서의 병태생리학에서의 그 효과는 피부 섬유아세포3에서도 연구될 수 있다.
시험관 내에서 SMC 수축의 높은 처리량 측정은 도전적입니다. SMC 수축성은 인간에서 생체 내에서 측정 될 수 없기 때문에 인간 세포에 대한 시험관 내 분석은 실현 가능한 대안을 제시합니다. 더욱이, 동물 모델에서의 복부 대동맥류(AAA) 발달은 예를 들어, 엘라스타제 관류에 의해 화학적으로 유도되거나, 또는 특정 돌연변이에 의해 유발된다. 따라서 동물 데이터는 흡연, 연령 및 / 또는 죽상 동맥 경화증과 같은 다각적 인 원인을 가진 인간의 AAA 발달과 비교할 수 없습니다. 시험관내 SMC 수축성은 지금까지 주로 견인력 현미경4,5, Fura-2 형광 세포내 칼슘 플럭스6의 정량화 및 콜라겐 주름 분석7에 의해 측정되었다. 견인력 현미경 검사는 단일 세포에 의해 생성 된 힘에 대한 귀중한 숫자 통찰력을 제공하지만 복잡한 수학적 데이터 처리 및 한 번에 하나의 세포 분석으로 인해 높은 처리량 스크리닝에는 적합하지 않으므로 기증자 당 대표적인 세포 수를 측정하는 데 매우 많은 시간이 소요됩니다. Fura-2 염료 및 콜라겐 주름 분석은 수축의 피상적 인 결정을 허용하고 정확한 수치 출력을 제공하지 않으므로 환자 별 차이를 구별하는 데 적합하지 않습니다. 복부 대동맥류 환자의 대동맥류로부터 유래된 세포에서 손상된 SMC 수축은 시험관내8에서 SMC 수축을 측정하기 위한 새로운 방법을 최적화함으로써 처음으로 입증되었다. 이는 전기 셀-기판 임피던스 감지(ECIS) 방법을 용도 변경함으로써 수행되었다. ECIS는 상처 치유 및 이동 분석(12,13,14)에서 SMC 성장 및 거동과 같은 부착성 세포 거동 및 수축 9,10,11의 정량화를 위한 실시간 중간 처리량 분석법이다. 정확한 방법은 프로토콜 섹션에 설명되어 있습니다. 이러한 최적화된 방식으로, ECIS는 또한 유사한 크기 및 형태학으로 인해 섬유아세포 수축을 연구하는데 사용될 수 있다.
이 논문의 목적은 ECIS8을 사용하여 시험관 내에서 SMC 수축을 측정하고 대조군과 환자 SMC 간의 수축을 비교하는 방법에 대한 단계적 설명을 제공하는 것입니다. 첫째, 대조군 및 환자 대동맥 생검으로부터 일차 SMCs의 분리 및 배양이 설명되며, 이는 수축 측정에 사용될 수 있다. 둘째, 수축 측정 및 분석, SMC 마커 발현의 검증이 설명된다. 또한,이 논문은 동일한 방법론을 사용하여 수축을 측정 할 수있는 환자 특정 진피 섬유 아세포의 분리 방법을 설명합니다. 이들 세포는 대동맥류 또는 다른 심혈관 병리(15)에 초점을 맞춘 환자 특이적 연구 또는 동맥류 수술 전에 수축 측정을 허용하는 전분화 프로토콜을 이용한 예후 연구(16)에 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 임피던스 및 표면 점유의 변화를 기반으로 시험관 내에서 SMC 수축을 측정하는 방법을 제시합니다. 먼저, 환자 특이적 일차 인간 SMC 및 피부 섬유아세포의 단리, 배양 및 확장이 설명되고, 이어서 수축 측정에 이를 사용하는 방법이 설명된다.
연구의 한계는 explant 프로토콜을 통해 세포를 얻는 것과 관련이 있습니다. 생검에서 증식하는 세포는 생체 내에서<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA 팀 및 암스테르담 UMC, Zaans Medisch Centrum 및 Dijklander 병원의 모든 혈관 외과 의사가이 연구에 대한 자료와 지원을 제공 한 것에 대해 감사하게 생각합니다.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Referências
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