Isolering av primære pasientspesifikke aorta glatte muskelceller og semikantative sanntidskontraksjonsmålinger i Vitro
Summary
Denne artikkelen beskriver en utvisningskulturbasert metode for isolering og dyrking av primære, pasientspesifikke humane aorta glatte muskelceller og dermale fibroblaster. Videre presenteres en ny metode for måling av cellesammentrekning og påfølgende analyse, som kan brukes til å studere pasientspesifikke forskjeller i disse cellene.
Abstract
Glatte muskelceller (SMB-er) er den dominerende celletypen i aortamediet. Deres kontraktile maskineri er viktig for overføring av kraft i aorta og regulerer vasokonstriksjon og vasodilatasjon. Mutasjoner i genkoding for SMC-kontraktile apparatproteiner er forbundet med aortasykdommer, for eksempel thorax aortaaneurisme. Måling av SMC-sammentrekning in vitro er utfordrende, spesielt på en høy gjennomstrømningsmåte, noe som er viktig for screening av pasientmateriale. Tilgjengelige metoder er for øyeblikket ikke egnet for dette formålet. Dette dokumentet presenterer en ny metode basert på elektrisk celle-substrat impedans sensing (ECIS). For det første beskrives en explantprotokoll for å isolere pasientspesifikke humane primær-SMCer fra aortabiopsier og pasientspesifikke humane primære dermale fibroblaster for studiet av aortaaneurisme. Deretter gis en detaljert beskrivelse av en ny sammentrekningsmetode for å måle kontraktilresponsen til disse cellene, inkludert den påfølgende analysen og forslaget til sammenligning av forskjellige grupper. Denne metoden kan brukes til å studere sammentrekning av tilhengerceller i sammenheng med translasjonelle (kardiovaskulære) studier og pasient- og legemiddelscreeningsstudier.
Introduction
Glatte muskelceller (SMCer) er den dominerende celletypen i aortamediallaget, det tykkeste laget av aorta. Innenfor veggen er de radialt orientert og er involvert i blant annet vasokonstriksjon og vasodilasjon1. SMC-kontraktilmaskineriet er involvert i overføring av kraft i aorta gjennom den funksjonelle koblingen med den ekstracellulære matrisen2. Mutasjoner i genkoding for proteinene i SMC-kontraktilapparatet, som glatt muskel myosin tung kjede (MYH11) og glatt muskel aktin (ACTA2), har vært relatert til tilfeller av familiær thoracic aorta aneurisme, understreke relevansen av SMC sammentrekning i opprettholde strukturell og funksjonell integritet av aorta 1,2 . Videre er mutasjoner i TGFβ-signalveien også forbundet med aortaaneurisme, og deres effekter i aortaaneurisme patofysiologi kan også studeres i huden fibroblaster3.
Høy gjennomstrømningsmåling av SMC-sammentrekning in vitro er utfordrende. Siden SMC-kontraktilitet ikke kan måles in vivo hos mennesker, presenterer in vitro-analyser på menneskelige celler et mulig alternativ. Videre er abdominal aortaaneurisme (AAA) utvikling i dyremodeller enten kjemisk indusert av for eksempel elastase perfusjon, eller forårsaket av en bestemt mutasjon. Derfor er dyredata ikke sammenlignbare med AAA-utvikling hos mennesker, som for det meste har en multifaktoriell årsak, for eksempel røyking, alder og / eller aterosklerose. Introduksjon SMC kontraktilitet har så langt hovedsakelig blitt målt ved trekkraft mikroskopi 4,5, kvantifisering av Fura-2 fluorescens intracellulær kalsiumflukser6, og kollagen rynke analyser7. Mens trekkraftmikroskopi gir uvurderlig numerisk innsikt i kreftene som genereres av en enkelt celle, er den ikke egnet for screening av høy gjennomstrømning på grunn av den komplekse matematiske databehandlingen og analysen av en celle om gangen, noe som betyr at det er svært tidkrevende å måle et representativt antall celler per donor. Fura-2 fargestoff og kollagen rynker analyser tillater overfladisk bestemmelse av sammentrekning og gir ikke en presis numerisk utgang, noe som gjør dem mindre egnet for å diskriminere pasientspesifikke forskjeller. Svekket SMC-sammentrekning i celler avledet fra aorta hos abdominale aortaaneurismepasienter ble demonstrert for første gang ved å optimalisere en ny metode for måling av SMC-sammentrekning in vitro8. Dette ble gjort ved å gjenbruke den elektriske celle-substrat impedans sensing (ECIS) metoden. ECIS er en sanntids, middels gjennomstrømningsanalyse for kvantifisering av tilhengercelleadferd og sammentrekning 9,10,11 som SMC-vekst og oppførsel i sårheling og migrasjonsanalyser 12,13,14. Den nøyaktige metoden er beskrevet i protokolldelen. På denne optimaliserte måten kan ECIS også brukes til å studere fibroblastkontraksjon på grunn av deres lignende størrelse og morfologi.
Målet med dette dokumentet er å gi en trinnvis beskrivelse av metoden for måling av SMC-sammentrekningsin vitro ved hjelp av ECIS8 og sammenligning av sammentrekningen mellom kontroll og pasient-SMCer. For det første forklares isolasjon og dyrking av primære SMB-er fra kontroll og pasientaortabiopsier, som kan brukes til sammentrekningsmåling. For det andre beskrives sammentrekningsmålinger og analyse, sammen med verifiseringen av SMC-markøruttrykk. Videre beskriver dette dokumentet metoden for isolering av pasientspesifikke dermale fibroblaster hvis sammentrekning kan måles ved hjelp av samme metodikk. Disse cellene kan brukes til pasientspesifikke studier fokusert på aortaaneurisme eller andre kardiovaskulære patologier15 eller prognostiske studier ved hjelp av en transdifferensiasjonsprotokoll som tillater sammentrekningsmåling før aneurismekirurgi16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette dokumentet presenterer en metode for å måle SMC-sammentrekning in vitro, basert på endringene i impedans og overflate okkupasjon. For det første beskrives isolasjon, dyrking og utvidelse av pasientspesifikke primære menneskelige SMB-er og hudfibroblaster, etterfulgt av hvordan du bruker dem til sammentrekningsmålinger.
En begrensning i studien er knyttet til å skaffe cellene gjennom en explant-protokoll. Cellene som sprer seg fra biopsien kan ha andre egenskaper enn det …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takknemlig anerkjenne Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA-teamet og alle vaskulære kirurger fra Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum og Dijklander sykehus for å gi materialer og støtte til denne studien.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Referências
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
