Aislamiento de células primarias del músculo liso aórtico específicas del paciente y mediciones semicuantitativas de contracción en tiempo real in vitro
Summary
Este artículo describe un método basado en el cultivo de explantes para el aislamiento y cultivo de células primarias del músculo liso aórtico humano específico del paciente y fibroblastos dérmicos. Además, se presenta un nuevo método para medir la contracción celular y el análisis posterior, que se puede utilizar para estudiar las diferencias específicas del paciente en estas células.
Abstract
Las células del músculo liso (SMC) son el tipo de célula predominante en los medios aórticos. Su maquinaria contráctil es importante para la transmisión de la fuerza en la aorta y regula la vasoconstricción y la vasodilatación. Las mutaciones en los genes que codifican para las proteínas del aparato contráctil SMC están asociadas con enfermedades aórticas, como los aneurismas de la aorta torácica. Medir la contracción de SMC in vitro es un desafío, especialmente de una manera de alto rendimiento, que es esencial para la detección de material del paciente. Los métodos actualmente disponibles no son adecuados para este propósito. Este artículo presenta un nuevo método basado en la detección de impedancia célula-sustrato eléctrico (ECIS). En primer lugar, se describe un protocolo de explante para aislar las SMC primarias humanas específicas del paciente a partir de biopsias aórticas y fibroblastos dérmicos primarios humanos específicos del paciente para el estudio de los aneurismas aórticos. A continuación, se da una descripción detallada de un nuevo método de contracción para medir la respuesta contráctil de estas células, incluido el análisis posterior y la sugerencia para comparar diferentes grupos. Este método se puede utilizar para estudiar la contracción de las células adherentes en el contexto de estudios traslacionales (cardiovasculares) y estudios de detección de pacientes y fármacos.
Introduction
Las células del músculo liso (SMC) son el tipo de célula predominante en la capa medial aórtica, la capa más gruesa de la aorta. Dentro de la pared, están orientados radialmente y están implicados, entre otras funciones, en la vasoconstricción y vasodilatación1. La maquinaria contráctil SMC está implicada en la transmisión de la fuerza en la aorta a través del enlace funcional con la matriz extracelular2. Las mutaciones en genes que codifican para las proteínas del aparato contráctil SMC, como la cadena pesada de miosina del músculo liso (MYH11) y la actina del músculo liso (ACTA2), se han relacionado con casos de aneurismas aórticos torácicos familiares, lo que subraya la relevancia de la contracción SMC en el mantenimiento de la integridad estructural y funcional de la aorta 1,2 . Además, las mutaciones en la vía de señalización TGFβ también se asocian con aneurismas aórticos, y sus efectos en la fisiopatología del aneurisma aórtico también se pueden estudiar en fibroblastos cutáneos3.
La medición de alto rendimiento de la contracción de SMC in vitro es un desafío. Como la contractilidad de SMC no se puede medir in vivo en humanos, los ensayos in vitro en células humanas presentan una alternativa factible. Además, el desarrollo del aneurisma aórtico abdominal (AAA) en modelos animales es inducido químicamente por, por ejemplo, la perfusión de elastasa o causado por una mutación específica. Por lo tanto, los datos en animales no son comparables al desarrollo de AAA en humanos, que en su mayoría tiene una causa multifactorial, como fumar, la edad y / o la aterosclerosis. In vitro Hasta ahora, la contractilidad de SMC se ha medido principalmente mediante microscopía de fuerza de tracción 4,5, cuantificación de flujos de calcio intracelulares de fluorescencia Fura-26 y ensayos de arrugas de colágeno7. Si bien la microscopía de fuerza de tracción proporciona una visión numérica invaluable de las fuerzas generadas por una sola célula, no es adecuada para la detección de alto rendimiento debido al complejo procesamiento matemático de datos y el análisis de una célula a la vez, lo que significa que lleva mucho tiempo medir un número representativo de células por donante. Los ensayos de colorante Fura-2 y arrugas de colágeno permiten la determinación superficial de la contracción y no dan una salida numérica precisa, lo que los hace menos adecuados para discriminar las diferencias específicas del paciente. La alteración de la contracción de SMC en células derivadas de la aorta de pacientes con aneurisma aórtico abdominal se demostró por primera vez mediante la optimización de un nuevo método para medir la contracción de SMC in vitro8. Esto se hizo reutilizando el método de detección de impedancia célula-sustrato eléctrico (ECIS). ECIS es un ensayo en tiempo real de rendimiento medio para la cuantificación del comportamiento y la contracción de las células adherentes 9,10,11, como el crecimiento y el comportamiento de SMC en ensayos de cicatrización de heridas y migración 12,13,14. El método exacto se describe en la sección de protocolo. De esta manera optimizada, el ECIS también se puede utilizar para estudiar la contracción de los fibroblastos debido a su tamaño y morfología similares.
El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción gradual del método para medir la contracción de SMC in vitro utilizando ECIS8 y comparar la contracción entre los SMC de control y pacientes. En primer lugar, se explica el aislamiento y el cultivo de los SMC primarios a partir de biopsias de control y aórticas de pacientes, que pueden utilizarse para la medición de la contracción. En segundo lugar, se describen las mediciones y el análisis de la contracción, junto con la verificación de la expresión del marcador SMC. Además, en este trabajo se describe el método para el aislamiento de fibroblastos dérmicos específicos del paciente cuya contracción puede medirse utilizando la misma metodología. Estas células pueden ser utilizadas para estudios específicos del paciente centrados en el aneurisma aórtico u otras patologías cardiovasculares15 o estudios pronósticos utilizando un protocolo de transdiferenciación que permite la medición de la contracción antes de la cirugía de aneurisma16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta un método para medir la contracción de SMC in vitro, basado en los cambios en la impedancia y la ocupación de la superficie. Primero, se describe el aislamiento, el cultivo y la expansión de los SMC humanos primarios específicos del paciente y los fibroblastos de la piel, seguidos de cómo usarlos para las mediciones de contracción.
Una limitación del estudio está relacionada con la obtención de las células a través de un protocolo de explante. Las …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, el equipo PAREL-AAA y todos los cirujanos vasculares de la UMC de Ámsterdam, Zaans Medisch Centrum y el hospital Dijklander por proporcionar materiales y apoyo para este estudio.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Referências
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