Isolering av primära patientspecifika aorta glatta muskelceller och semikvantitiva realtidskontraktionsmätningar in vitro
Summary
Denna uppsats beskriver en explantkulturbaserad metod för isolering och odling av primära, patientspecifika humana aorta glatta muskelceller och dermala fibroblaster. Vidare presenteras en ny metod för att mäta cellkontraktion och efterföljande analys, som kan användas för att studera patientspecifika skillnader i dessa celler.
Abstract
Glattmuskelceller (SMC) är den dominerande celltypen i aortamediet. Deras kontraktila maskineri är viktigt för överföring av kraft i aortan och reglerar vasokonstriktion och vasodilatation. Mutationer i gener som kodar för SMC-kontraktila apparatproteiner är associerade med aortasjukdomar, såsom thoraxaortaaneurysmer. Att mäta SMC-sammandragning in vitro är utmanande, särskilt på ett sätt med hög genomströmning, vilket är viktigt för screening av patientmaterial. För närvarande tillgängliga metoder är inte lämpliga för detta ändamål. Detta dokument presenterar en ny metod baserad på elektrisk cell-substratimpedansavkänning (ECIS). Först beskrivs ett explantprotokoll för att isolera patientspecifika humana primära SMC från aortabiopsier och patientspecifika humana primära dermala fibroblaster för studier av aorta aneurysmer. Därefter ges en detaljerad beskrivning av en ny sammandragningsmetod för att mäta kontraktilresponsen hos dessa celler, inklusive efterföljande analys och förslag till jämförelse av olika grupper. Denna metod kan användas för att studera sammandragningen av vidhäftande celler i samband med translationella (kardiovaskulära) studier och patient- och läkemedelsscreeningstudier.
Introduction
Glattmuskelceller (SMC) är den dominerande celltypen i aortamedialskiktet, det tjockaste lagret av aortan. Inom väggen är de radiellt orienterade och är involverade i bland annat vasokonstriktion och vasodilatation1. SMC-kontraktilmaskineriet är involverat i överföringen av kraft i aortan genom den funktionella länken med den extracellulära matrisen2. Mutationer i gener som kodar för proteinerna i SMC-kontraktilapparaten, såsom glattmuskel myosin tung kedja (MYH11) och glattmuskelaktin (ACTA2), har varit relaterade till fall av familjära thoraxaortaaneurysmer, vilket understryker relevansen av SMC-sammandragning för att upprätthålla den strukturella och funktionella integriteten hos aortan 1,2 . Vidare är mutationer i TGFβ-signalvägen också associerade med aortaaneurysmer, och deras effekter i aortaaneurysm patofysiologi kan också studeras i hudfibroblaster3.
Mätning med hög genomströmning av SMC-sammandragning in vitro är utmanande. Eftersom SMC-kontraktilitet inte kan mätas in vivo hos människor, utgör in vitro-analyser på mänskliga celler ett genomförbart alternativ. Dessutom är utvecklingen av bukaortaaneurysm (AAA) i djurmodeller antingen kemiskt inducerad av exempelvis elastasperfusion eller orsakad av en specifik mutation. Därför är djurdata inte jämförbara med AAA-utveckling hos människor, som oftast har en multifaktoriell orsak, såsom rökning, ålder och/eller ateroskleros. In vitro SMC-kontraktilitet har hittills huvudsakligen mätts med dragkraftsmikroskopi 4,5, kvantifiering av Fura-2 fluorescens intracellulära kalciumflöden6 och kollagenrynkningsanalyser7. Medan dragkraftsmikroskopi ger ovärderlig numerisk inblick i de krafter som genereras av en enda cell, är den inte lämplig för screening med hög genomströmning på grund av den komplexa matematiska databehandlingen och analysen av en cell i taget, vilket innebär att det är mycket tidskrävande att mäta ett representativt antal celler per givare. Fura-2-färgämnes- och kollagenrynkningsanalyser möjliggör ytlig bestämning av sammandragning och ger inte en exakt numerisk utgång, vilket gör dem mindre lämpliga för att diskriminera patientspecifika skillnader. Försämrad SMC-sammandragning i celler härledda från aorta hos patienter med bukaortaaneurysm demonstrerades för första gången genom att optimera en ny metod för att mäta SMC-sammandragning in vitro8. Detta gjordes genom att återanvända ECIS-metoden (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing). ECIS är en realtidsanalys med medelhög genomströmning för kvantifiering av vidhäftande cellbeteende och sammandragning 9,10,11 såsom SMC-tillväxt och beteende i sårläknings- och migrationsanalyser 12,13,14. Den exakta metoden beskrivs i protokollavsnittet. På detta optimerade sätt kan ECIS också användas för att studera fibroblastkontraktion på grund av deras liknande storlek och morfologi.
Syftet med denna uppsats är att ge en stegvis beskrivning av metoden för att mäta SMC-sammandragning in vitro med ECIS8 och jämföra sammandragningen mellan kontroll- och patient-SMC. Först förklaras isolering och odling av primära SMC från kontroll- och patientaortabiopsier, som kan användas för sammandragningsmätning. För det andra beskrivs sammandragningsmätningar och analyser, tillsammans med verifieringen av SMC-marköruttryck. Vidare beskriver denna uppsats metoden för isolering av patientspecifika dermala fibroblaster vars sammandragning kan mätas med samma metodik. Dessa celler kan användas för patientspecifika studier med fokus på aortaaneurysm eller andra kardiovaskulära patologier15 eller prognostiska studier med hjälp av ett transdifferentieringsprotokoll som möjliggör sammandragningsmätning före aneurysmkirurgi16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument presenterar en metod för att mäta SMC-sammandragning in vitro, baserat på förändringar i impedans och ytockupation. Först beskrivs isolering, odling och expansion av patientspecifika primära humana SMC och hudfibroblaster, följt av hur man använder dem för sammandragningsmätningar.
En begränsning av studien är relaterad till att erhålla cellerna genom ett explantprotokoll. Cellerna som förökar sig från biopsin kan ha andra egenskaper än den ursprungli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacksamt tacka Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA-teamet och alla kärlkirurger i Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum och Dijklander sjukhus för att tillhandahålla material och stöd för denna studie.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Referências
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
