Primer Hastaya Özgü Aort Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Yarı Kantitatif Gerçek Zamanlı Kasılma Ölçümleri In Vitro
Summary
Bu yazıda birincil, hastaya özgü insan aort düz kas hücrelerinin ve dermal fibroblastların izolasyonu ve kültürlenmesi için eksplant kültürüne dayalı bir yöntem anlatılmaktadır. Ayrıca, hücre kasılmasını ölçmek ve daha sonra bu hücrelerdeki hastaya özgü farklılıkları incelemek için kullanılabilecek yeni bir yöntem sunulmaktadır.
Abstract
Düz kas hücreleri (SMC’ler) aort ortamındaki baskın hücre tipidir. Kasılma mekanizmaları aorttaki kuvvetin iletimi için önemlidir ve vazokonstriksiyon ve vazodilatasyonu düzenler. SMC kontraktil aparat proteinlerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar, torasik aort anevrizmaları gibi aort hastalıkları ile ilişkilidir. SMC kasılmasını in vitro olarak ölçmek, özellikle hasta materyalini taramak için gerekli olan yüksek verimli bir şekilde zordur. Şu anda mevcut yöntemler bu amaç için uygun değildir. Bu yazıda elektrik hücre-substrat empedans algılamasına (ECIS) dayanan yeni bir yöntem sunulmaktadır. İlk olarak, aort anevrizmalarının incelenmesi için hastaya özgü insan primer SMC’lerini aort biyopsilerinden ve hastaya özgü insan primer dermal fibroblastlarından izole etmek için bir eksplant protokolü tanımlanmıştır. Daha sonra, bu hücrelerin kasılma tepkisini ölçmek için, farklı grupları karşılaştırmak için sonraki analiz ve öneri de dahil olmak üzere yeni bir kasılma yönteminin ayrıntılı bir açıklaması verilir. Bu yöntem, translasyonel (kardiyovasküler) çalışmalar ve hasta ve ilaç tarama çalışmaları bağlamında yapışkan hücrelerin kasılmasını incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Düz kas hücreleri (SMC’ler), aortun en kalın tabakası olan aort medial tabakasında baskın hücre tipidir. Duvar içinde, radyal olarak yönlendirilirler ve diğer fonksiyonların yanı sıra vazokonstriksiyon ve vazodilatasyon1’de rol oynarlar. SMC kontraktil makinesi, aorttaki kuvvetin hücre dışı matris2 ile fonksiyonel bağlantı yoluyla iletilmesinde rol oynar. Düz kas miyozin ağır zinciri (MYH11) ve düz kas aktini (ACTA2) gibi SMC kontraktil aparatının proteinlerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar, ailesel torasik aort anevrizması vakalarıyla ilişkilendirilmiş ve SMC kasılmasının aortun yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünün korunmasındaki önemini vurgulamıştır 1,2 . Ayrıca, TGFβ sinyal yolundaki mutasyonlar da aort anevrizmaları ile ilişkilidir ve bunların aort anevrizması patofizyolojisindeki etkileri deri fibroblastlarında da incelenebilir3.
SMC kasılmasının in vitro yüksek verimli ölçümü zordur. SMC kontraktilitesi insanlarda in vivo olarak ölçülemediğinden, insan hücreleri üzerindeki in vitro testler uygulanabilir bir alternatif sunar. Ayrıca, hayvan modellerinde abdominal aort anevrizması (AAA) gelişimi, örneğin elastaz perfüzyonu tarafından kimyasal olarak indüklenir veya spesifik bir mutasyondan kaynaklanır. Bu nedenle, hayvan verileri, çoğunlukla sigara, yaş ve / veya ateroskleroz gibi çok faktörlü bir nedene sahip olan insanlarda AAA gelişimi ile karşılaştırılamaz. İn vitro SMC kontraktilitesi şimdiye kadar esas olarak traksiyon kuvveti mikroskobu4,5, Fura-2 floresan hücre içi kalsiyum akılarının nicelleştirilmesi6 ve kollajen buruşma tahlilleri7 ile ölçülmüştür. Çekiş kuvveti mikroskobu, tek bir hücre tarafından üretilen kuvvetler hakkında paha biçilmez sayısal bilgiler sağlarken, karmaşık matematiksel veri işleme ve bir seferde bir hücrenin analizi nedeniyle yüksek verimli tarama için uygun değildir, bu da donör başına temsili bir hücre sayısını ölçmenin çok zaman alıcı olduğu anlamına gelir. Fura-2 boya ve kollajen kırışma testleri, kasılmanın yüzeysel olarak belirlenmesine izin verir ve kesin bir sayısal çıktı vermez, bu da onları hastaya özgü farklılıkları ayırt etmek için daha az uygun hale getirir. Abdominal aort anevrizması hastalarının aortundan türetilen hücrelerde bozulmuş SMC kontraksiyonu, SMC kontraksiyonunu in vitro8 ölçmek için yeni bir yöntemin optimize edilmesiyle ilk kez gösterilmiştir. Bu, elektrik hücre-substrat empedans algılama (ECIS) yönteminin yeniden kullanılmasıyla yapıldı. ECIS, SMC büyümesi ve yara iyileşmesi ve göç tahlillerinde davranış 12,13,14 gibi yapışkan hücre davranışı ve kasılmasının 9,10,11 miktarının ölçülmesi için gerçek zamanlı, orta verimli bir testtir. Tam yöntem protokol bölümünde açıklanmıştır. Bu optimize edilmiş şekilde, ECIS, benzer boyut ve morfolojileri nedeniyle fibroblast kasılmasını incelemek için de kullanılabilir.
Bu makalenin amacı, ECIS8 kullanarak SMC kontraksiyonunu in vitro olarak ölçme yönteminin aşamalı bir tanımını sağlamak ve kontrol ile hasta SMC’leri arasındaki kontraksiyonu karşılaştırmaktır. İlk olarak, primer SMC’lerin kontrol ve hasta aort biyopsilerinden izole edilmesi ve kültürlenmesi, kasılma ölçümü için kullanılabilecek şekilde açıklanmaktadır. İkincisi, SMC belirteç ifadesinin doğrulanmasının yanı sıra kasılma ölçümleri ve analizi açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yazıda aynı metodoloji kullanılarak kontraksiyonu ölçülebilen hastaya özgü dermal fibroblastların izolasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu hücreler, aort anevrizması veya diğer kardiyovasküler patolojilere odaklanan hastaya özgü çalışmalariçin kullanılabilir 15 veya anevrizma cerrahisinden önce kasılma ölçümüne izin veren bir transdiferansiyasyon protokolü kullanan prognostik çalışmalar16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, SMC kasılmasını in vitro olarak ölçmek için, empedans ve yüzey işgalindeki değişikliklere dayanarak bir yöntem sunulmaktadır. İlk olarak, hastaya özgü primer insan SMC’lerinin ve cilt fibroblastlarının izolasyonu, kültürlenmesi ve genişlemesi, ardından bunların kasılma ölçümleri için nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.
Çalışmanın bir sınırlaması, hücrelerin bir eksplant protokolü yoluyla elde edilmesiyle ilgilidir. Biyopsiden ç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA ekibi ve Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum ve Dijklander hastanesinin tüm vasküler cerrahlarına bu çalışma için malzeme ve destek sağladıkları için minnetle teşekkür ederiz.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Referências
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
