Økonomisk og effektiv protokol til isolering og dyrkning af knoglemarvsafledte dendritiske celler fra mus

Summary

Her præsenterer vi en økonomisk og effektiv metode til at isolere og generere knoglemarvsafledte dendritiske celler med høj renhed fra mus efter 7 dages dyrkning med 10 ng/ml GM-CSF/IL-4.

Abstract

Efterspørgslen efter dendritiske celler (LLC’er) stiger gradvist, efterhånden som immunologiforskningen skrider frem. DCs er dog sjældne i alle væv. Den traditionelle metode til isolering af DC’er involverer primært inducering af knoglemarvsdifferentiering (BM) i DC’er ved at injicere store doser (>10 ng / ml) granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor / interleukin-4 (GM-CSF / IL-4), hvilket gør proceduren kompleks og dyr. I denne protokol blev der ved anvendelse af alle BM-celler dyrket i 10 ng / ml GM-CSF / IL-4-medium efter 3-4 halvkulturudvekslinger høstet op til 2,7 x 10⁷ CD11c ⁺ celler (DC’er) pr. Mus (to lårben) med en renhed på 80% -95%. Efter 10 dage i kultur steg ekspressionen af CD11c, CD80 og MHC II, mens antallet af celler faldt. Antallet af celler toppede efter 7 dages dyrkning. Desuden tog denne metode kun 10 minutter at høste alle knoglemarvsceller, og et stort antal LLC’er blev opnået efter 1 uges dyrkning.

Introduction

Dendritiske celler (DC’er) er de mest kraftfulde antigenpræsenterende celler (APC’er) til aktivering af naive T-celler og inducering af specifikke cytotoksiske T-lymfocytresponser (CTL) mod infektionssygdomme, allergisygdomme og tumorceller ^1,2,3. DCs er den primære forbindelse mellem medfødt immunitet og adaptiv immunitet og spiller en væsentlig rolle i immunologisk forsvar og opretholdelse af immuntolerance. I de sidste 40 år har mange forskere forsøgt at definere delmængderne af LLC’er og deres funktioner i betændelse og immunitet. I henhold til disse undersøgelser udviklerDC’er sig langs myeloide og lymfoide slægter fra knoglemarvsceller. Tumorvacciner har fået betydelige milepæle i de senere år og har en lovende fremtid. Mekanisk modulerer tumorvacciner immunresponsen og forhindrer tumorvækst ved at aktivere cytotoksiske T-lymfocytter ved anvendelse af tumorantigener. Vaccinen baseret på DCs spiller en vigtig rolle i tumorimmunterapi og er blevet identificeret som en af de mest lovende antitumorterapier ^1,4. Derudover erDC’er blevet anvendt i vid udstrækning til test af nye molekylære målrettede lægemidler og immun checkpoint-hæmmere⁵.

Forskere har akut brug for et stort antalDC’er med høj renhed for yderligere at studereDC’ernes rolle. DCs er imidlertid sjældne i forskellige væv og blod, der kun tegner sig for 1% af blodlegemer hos mennesker og dyr. In vitro-dyrkning af knoglemarvsdendritiske celler (BMDC) er en vigtig metode til opnåelse af store mængder DC-celler. I mellemtiden er Lutz-protokollen til generering af VC’er fra knoglemarv blevet brugt i vid udstrækning af forskere⁶. Selvom protokollen er effektiv til opnåelse af DC-celler, er den kompleks og dyr, hvilket involverer tilsætning af høje koncentrationer af cytokiner og lysis af røde blodlegemer.

I denne undersøgelse rapporterer vi en metode til isolering af næsten alle knoglemarvsceller fra museknoglemarv (BM) og inducering af differentiering i BMDC efter 7-9 dages inkubation in vitro med en lavere koncentration af GM-CSF og IL-4. Denne procedure tager kun 10 minutter at høste næsten alle knoglemarvsceller og suspendere dem i et komplet medium. Kort fortalt leverer vi en effektiv og omkostningseffektiv dyrkningsmetode til BMDC i denne forskning.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee. 1. Isolering af knoglemarv og forberedelse af BM-celler Ofre C57BL/6 mus (18-22 g, 6-8 uger gamle) via CO2 kvælning. Fastgør musen på musens operationsbord. Desinficer overfladerne med 70% ethanol. Skær benets hud for at udsætte musklerne og lårbensarterien. Klem og riv lårbensarterien ved hjælp af to tang, og træk derefter den proksimale ende mod …

Representative Results

De 1 x 10 7-1,7 x 107 celler blev ekstraheret fra to lårben og blev genophængt i 24 ml medium, før de blev plantet i en 6-brønds plade (figur 1A). Efter 2 dage blev ikke-klæbende celler fjernet ved fuldstændigt at ændre kulturmediet. Før mediet blev skiftet, blev der observeret et betydeligt antal suspenderede celler (figur 1B). Efter 3 dages kultur begyndte småcellekolonier at danne sig. På den sjette dag steg størrelsen og anta…

Discussion

Mennesker og mus har forskellige DC-undergrupper, herunder klassiske DC’er (cDC’er, herunder cDC1’er og cDC2’er) plasmacytoid-DC’er (pDC’er) og monocytafledte DC’er (MoDC’er)^9,10,11. Det er generelt accepteret, at cDC1’er regulerer cytotoksiske T-lymfocyt (CTL) reaktioner på intracellulære patogener og kræft, og cDC2’er regulerer immunresponser på ekstracellulære patogener, parasitter og allergener¹²…

Materials

β-Mercaptoethanol	Solarbio	M8211
6-well plate	Corning	3516
APC-MHC II	Biolegend	116417
FBS	Gibco	10100
PE-CD80	Biolegend	104707
Penicillin-Streptomycin	Solarbio	P1400
Percp/cy5.5-CD11c	Biolegend	117327
PRMI-1640	Thermo	11875093
Recombinant Mouse GM-CSF	Solarbio	P00184
Recombinant Mouse IL-4	Solarbio	P00196
TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	156603