Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Summary

Questo articolo descrive un saggio di colorazione lectina ben consolidato e riproducibile per l’intero monte di preparati retinici e i protocolli necessari per la misurazione quantitativa di parametri vascolari frequentemente alterati nelle retinopatie proliferative e non proliferative.

Abstract

Le retinopatie sono un gruppo eterogeneo di malattie che colpiscono il tessuto neurosensoriale dell’occhio. Sono caratterizzati da neurodegenerazione, gliosi e un progressivo cambiamento della funzione e della struttura vascolare. Sebbene l’insorgenza delle retinopatie sia caratterizzata da sottili disturbi nella percezione visiva, le modifiche nel plesso vascolare sono i primi segni rilevati dai medici. L’assenza o la presenza di neovascolarizzazione determina se la retinopatia è classificata come non proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). In questo senso, diversi modelli animali hanno cercato di imitare specifiche caratteristiche vascolari di ogni stadio per determinare i meccanismi sottostanti coinvolti nelle alterazioni dell’endotelio, nella morte neuronale e in altri eventi che si verificano nella retina. In questo articolo, forniremo una descrizione completa delle procedure necessarie per la misurazione dei parametri vascolari retinici negli adulti e nei topi di parto precoce al giorno postnatale (P)17. Descriveremo in dettaglio i protocolli per eseguire la colorazione vascolare retinica con Isolectina GSA-IB4 in supporti interi per una successiva visualizzazione microscopica. Vengono inoltre forniti passaggi chiave per l’elaborazione delle immagini con il software Image J Fiji, pertanto i lettori saranno in grado di misurare la densità del vaso, il diametro e la tortuosità, la ramificazione vascolare e le aree avascolari e neovascolari. Questi strumenti sono molto utili per valutare e quantificare le alterazioni vascolari sia nelle retinopatie non proliferative che in quelle proliferative.

Introduction

Gli occhi sono nutriti da due sistemi arterio-venosi: la vascolarizzazione coroidale, una rete vascolare esterna che irriga l’epitelio pigmentato retinico e i fotorecettori; e la vascolarizzazione neuro-retinica che irriga lo strato di cellule gangliari e lo strato nucleare interno della ^retina1. La vascolarizzazione retinica è una rete organizzata di vasi che forniscono nutrienti e ossigeno alle cellule retiniche e raccolgono prodotti di scarto per garantire una corretta trasduzione della segnalazione visiva. Questa vascolarizzazione ha alcune caratteristiche distinte, tra cui: la mancanza di innervazione autonoma, la regolazione del tono vascolare da meccanismi retinici intrinseci e il possesso di una complessa barriera retinico-ematica2. Pertanto, la vascolarizzazione retinica è stata al centro di molti ricercatori che hanno ampiamente studiato non solo la vasculogenesi durante lo sviluppo, ma anche le alterazioni e l’angiogenesi patologica che questi vasi subiscono nelle ^malattie3. I cambiamenti vascolari più comuni osservati nelle retinopatie sono la dilatazione dei vasi, la neovascolarizzazione, la perdita di arborizzazione vascolare e la deformazione dei vasi principali della retina, che li rende più ziggaggy4,5,6. Una o più delle alterazioni descritte sono i primi segni che devono essere rilevati dai medici. La visualizzazione vascolare fornisce un metodo di screening rapido, non invasivo ed ^economico7. Lo studio approfondito delle alterazioni osservate nell’albero vascolare determinerà se la retinopatia non è proliferativa o proliferativa e l’ulteriore trattamento. Le retinopatie non proliferative possono manifestarsi con morfologia vascolare aberrante, diminuzione della densità vascolare, capillari acellulari, morte dei periciti, edema maculare, tra gli altri. Inoltre, le retinopatie proliferative sviluppano anche una maggiore permeabilità vascolare, rimodellamento extracellulare e formazione di ciuffi vascolari verso la cavità vitrea che facilmente si rompono o inducono il distacco della ^retina8.

Una volta rilevata, la retinopatia può essere monitorata attraverso i suoi cambiamenti ^{vascolari9,10}. La progressione della patologia può essere seguita attraverso i cambiamenti strutturali dei vasi, che definiscono chiaramente le fasi della ^malattia11. La quantificazione delle alterazioni vascolari in questi modelli ha permesso di correlare i cambiamenti vascolari e la morte neuronale e di testare terapie farmacologiche per pazienti in diverse fasi della malattia.

Alla luce delle affermazioni di cui sopra, riteniamo che il riconoscimento e la quantificazione delle alterazioni vascolari siano fondamentali negli studi sulle retinopatie. In questo lavoro, mostreremo come misurare diversi parametri vascolari. Per fare ciò, impiegheremo due modelli animali. Uno di questi è il modello murino di retinopatia indotta da ^ossigeno12, che imita la retinopatia della prematurità e alcuni aspetti della retinopatia diabetica proliferativa13,14. In questo modello, misureremo le aree avascolare, le aree neovascolari e la dilatazione e la tortuosità dei vasi principali. Nel nostro laboratorio è stato sviluppato un modello murino di Sindrome Metabolica (MetS), che induce una retinopatia non ^{proliferativa15}. Qui, valuteremo la densità vascolare e la ramificazione.

Protocol

I topi C57BL / 6J sono stati gestiti secondo le linee guida della dichiarazione ARVO per l’uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. Le procedure sperimentali sono state progettate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (CICUAL) della Facoltà di Scienze Chimiche, Università Nazionale di Córdoba (Res. HCD 1216/18). 1. Preparazione di soluzioni tampone e reagenti Preparazione di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS): A…

Representative Results

Come descritto nella sezione protocollo, da un singolo test di colorazione fluorescente è possibile ottenere la morfologia vascolare e valutare quantitativamente diversi parametri di interesse. La ricerca di un’alterazione specifica dipenderà dal tipo di retinopatia studiata. In questo articolo, le aree avascolare e neovascolare, la tortuosità e la dilatazione sono state valutate in un modello murino di retinopatia proliferativa, mentre la ramificazione e la densità vascolare sono state analizzate in un modello murin…

Discussion

I modelli animali di retinopatie sono potenti strumenti per studiare lo sviluppo vascolare, il rimodellamento o l’angiogenesi patologica. Il successo di questi studi sul campo si basa sul facile accesso al tessuto che consente di eseguire un’ampia varietà di tecniche, fornendo dati da topi in vivo e post mortem26,27. Inoltre, è stata trovata una grande correlazione tra studi in vivo e analisi cliniche, fornendo una solida tracciabilit…

Materials

Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis