不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas,Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI),Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Vitreo-retinal Department,Centro Privado de Ojos Romagosa-Fundación VER, 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA),Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)
Summary
この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。
Abstract
網膜症は、眼の神経感覚組織に影響を与える疾患の不均一なグループである。それらは神経変性、神経膠症および血管機能および構造の進行性の変化によって特徴付けられる。網膜症の発症は視覚の微妙な障害によって特徴付けられるが、血管叢の修飾は臨床医によって検出される最初の徴候である。新血管新生の不在または存在は、網膜症が不拡散(NPDR)または増殖(PDR)のいずれかに分類されるかどうかを決定する。この意味で、いくつかの動物モデルは、内皮変化、神経死および他の事象が、その他の事象に関与する根本的なメカニズムを決定するために、各段階の特定の血管特徴を模倣しようとした。本稿では、出生後(P)17日の成人および早期出産マウスにおけるレチナル血管パラメータの測定に必要な手順の完全な説明を行う。後の顕微鏡可視化のための全体の台紙のイソレチンGSA-IB4とのレチナル血管染色を行うためのプロトコルを詳述する。イメージJフィジーソフトウェアで画像処理のための重要なステップも提供されているので、読者は血管密度、直径およびトース性、血管分岐、ならびに血管および新血管領域を測定することができる。これらのツールは、不拡散性および増殖性網膜症の両方における血管変化を評価し、定量化するのに非常に有用である。
Introduction
目は2つの動脈静脈系によって栄養を与えられます:脈絡膜血管系、網膜色素上皮および光受容体を灌漑する外部血管ネットワーク。神経節細胞層とretina1の内部核層を灌漑する神経残性血管系。レチナル血管系は、栄養と酸素をレチナル細胞に供給し、廃棄物を収穫して適切な視覚シグナル伝達を確実にする血管の組織的ネットワークです。この血管系には、自律的な内インベーションの欠如、固有の筋機構による血管緊張の調節、複雑な筋血バリアの所持など、いくつかの特徴的な特徴があります2。したがって、血管系の血管系の研究は、開発中の血管形成だけでなく、これらの血管が疾患で受ける変化や病的血管新生も広く研究してきた多くの研究者の焦点となっています3。網膜症で観察される最も一般的な血管変化は、血管拡張、新血管新生、血管の樹状化および網膜主血管の変形の喪失であり、これらはよりジガギー4,5,6となる。記載された変更の1つ以上は、臨床医によって検出される最も初期の徴候である。血管の可視化は、迅速で、非侵襲的で、かつ安価なスクリーニング方法7を提供する。血管樹で観察される変化の広範な研究は、網膜症が不拡散または増殖性であるかどうかを決定し、さらなる治療を行う。不増殖性網膜症は、異常な血管形態、血管密度の低下、無細胞毛細血管、骨膜死、黄斑浮腫などで現れる。さらに、増殖性網膜症はまた、血管透過性の増加、細胞外リモデリング、および網膜剥離を容易に破壊または誘導する虚膜腔に向かう血管房の形成を発症する8。
一度検出されると、網膜症は、その血管変化を介して監視することができます9,10。病理の進行は、疾患の段階を明確に定義する血管の構造変化を通して追跡することができる11。これらのモデルにおける血管変化の定量化は、血管の変化と神経死を相関させ、疾患の異なる段階の患者に対する薬理学的療法を試験することを可能にした。
上記の記述に照らして、網膜症研究において血管変化の認識と定量化が基本であると考える。本研究では、異なる血管パラメータの測定方法を紹介する。そのために、2つの動物モデルを採用します。そのうちの一つは、未熟児網膜症および増殖性糖尿病網膜症13,14のいくつかの側面を模倣する酸素誘発網膜症マウスmodel12である。このモデルでは、血管領域、新血管領域、および主血管の拡張と拷問を測定します。当研究室では、メタボリックシンドローム(MetS)マウスモデルが開発されており、不拡散性網膜症15を誘導します。ここでは、血管密度と分岐を評価する。
Protocol
C57BL/6Jマウスは、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明のガイドラインに従って取り扱われた。実験手順は、コルドバ国立大学化学科学部の施設動物のケアと使用委員会(CICUAL)によって設計され、承認されました(Res. HCD 1216/18)。 1. 緩衝液および試薬の調製 1xリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)の調製:8gの塩化ナトリウム(NaCl)、0.2gの塩化カリ…
Representative Results
プロトコルセクションに記載されているように、単一の蛍光染色アッセイから、血管形態を取得し、目的の複数のパラメータを定量的に評価することができる。特定の変化の探索は、研究された網膜症の種類によって異なります。この記事では、血管領域と新血管領域、トース性、および拡張を増殖性網膜症のマウスモデルで評価し、血管分岐および密度をMetSマウスモデルで分析し、不拡散…
Discussion
網膜症の動物モデルは、血管の発達、リモデリング、または病理学的血管新生を研究するための強力なツールです。この分野でのこれらの研究の成功は、生体内および死後マウス26,27からのデータを提供し、多種多様な技術を実行することを可能にする組織への容易なアクセスに依存している。さらに、インビボ研究と臨床分析…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
カルロス・マス、マリア・ピラール・クレスポ、CEMINCOのセシリア・サンペドロ(セントロ・デ・ミクロ・イ・ナノスコピア・コルドバ、コニセトUNC、コルドバ、アルゼンチン)に対する共焦点顕微鏡の支援、ソレダッド・ミロとビクトリア・ブランコの専任動物ケア、ローラ・ガティカの神学的支援に感謝します。また、ビクター・ディアス(FCQの制度コミュニケーションのプロ秘書)に、ビデオ制作と版、ポール・ホブソンが原稿の批判的な読書と言語改訂に感謝します。
この記事は、セクレタリア・デ・シエンシア・イ・テクノロジアからの助成金によって資金提供されました。 ナシオナル・デ・コルドバ大学(SECyT-UNC)コソリサー2018-2021、フォンド・パラ・ラ・インベスティガシオン・シエンティフィカ・イ・テクノロギカ(FONCyT)、プロエクト・デ・インベスティガシオン・エン・シエンシア・イ・テクノロジア(PICT.C)
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
Referências
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Citar este artigo
Subirada, P. V., Paz, M. C., Vaglienti, M. V., Luna, J. D., Barcelona, P. F., Sánchez, M. C. Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies. J. Vis. Exp. (181), e63126, doi:10.3791/63126 (2022).