Kvantifiering av kärlparametrar i hela mount näthinnor hos möss med icke-proliferativa och proliferativa retinopatier
Summary
Denna artikel beskriver en väletablerad och reproducerbar lectin fläck analys för hela mount retinal preparat och protokoll som krävs för kvantitativ mätning av vaskulär parametrar ofta ändras i proliferative och icke-proliferative retinopathies.
Abstract
Retinopatier är en heterogen grupp av sjukdomar som påverkar ögats neurosensoriska vävnad. De kännetecknas av neurodegeneration, gliosis och en progressiv förändring i vaskulär funktion och struktur. Även om uppkomsten av retinopathies kännetecknas av subtila störningar i visuell uppfattning, är ändringarna i vaskulär plexus de första tecknen som upptäcks av kliniker. Frånvaron eller förekomsten av neovaskularisering avgör om retinopati klassificeras som antingen icke-proliferativ (NPDR) eller proliferativ (PDR). I den meningen försökte flera djurmodeller efterlikna specifika kärlegenskaper i varje steg för att bestämma de underliggande mekanismerna som är involverade i endotelförändringar, neuronal död och andra händelser som äger rum i näthinnan. I den här artikeln kommer vi att ge en fullständig beskrivning av de förfaranden som krävs för mätning av retinala kärlparametrar hos vuxna och tidiga födelsemöss vid postnatal dag (P)17. Vi kommer att beskriva protokollen för att utföra retinal vaskulär färgning med Isolectin GSA-IB4 i hela fästen för senare mikroskopisk visualisering. Viktiga steg för bildbehandling med Image J Fiji programvara tillhandahålls också, därför kommer läsarna att kunna mäta kärltäthet, diameter och tortuositet, vaskulär förgrening, liksom avaskådeliga och neovaskulära områden. Dessa verktyg är till stor hjälp för att utvärdera och kvantifiera vaskulär förändringar i både icke-proliferative och proliferative retinopathies.
Introduction
Ögonen närs av två arterio-venösa system: choroidal vaskulatur, ett externt vaskulär nätverk som bevattnar retinal pigmenterat epitel och fotoreceptorer; och den neuro-retinala vaskulaturen som bevattnar ganglioncellernas lager och näthinnans inre kärnskikt1. Näthinnevaskulaturen är ett organiserat nätverk av kärl som levererar näringsämnen och syre till näthinnecellerna och skördar avfallsprodukter för att säkerställa korrekt visuell signaltransduktion. Denna vaskulatur har några distinkta funktioner, inklusive: bristen på autonom innervation, reglering av vaskulär ton av inneboende retinal mekanismer och innehav av en komplex retinal-blod barriär2. Därför har retinal vaskulatur varit i fokus för många forskare som har studerat inte bara vasculogenes under utvecklingen, men också de förändringar och patologiska angiogenes som dessa fartyg genomgår i sjukdomar3. De vanligaste vaskulär förändringarna som observerats i retinopatier är kärl dilatation, neovaskularisering, förlust av vaskulär arborization och deformation av näthinnan huvudkärl, vilket gör dem mer ziggaggy4,5,6. En eller flera av de beskrivna ändringarna är de tidigaste tecknen som ska upptäckas av kliniker. Vaskulär visualisering ger en snabb, icke-invasiv och billig screeningmetod7. Den omfattande studien av de förändringar som observerats i kärlträdet kommer att avgöra om retinopatin är icke-proliferativ eller proliferativ och den fortsatta behandlingen. De icke-proliferative retinopathies kan manifestera sig med avvikande vaskulär morfologi, minskad vaskulär densitet, acellulära kapillärer, pericytes död, makulade ödem, bland andra. Dessutom utvecklar proliferative retinopathies också ökad vaskulär permeabilitet, extracellulära ombyggnad och bildandet av vaskulär tufts mot glaskropp håligheten som lätt nedbrytning eller inducera retinal detachement8.
När upptäckts kan retinopatin övervakas genom dess kärlförändringar9,10. Patologins progression kan följas genom kärlens strukturella förändringar, som tydligt definierar stadier av sjukdomen11. Kvantifiering av vaskulär förändringar i dessa modeller tillåtet att korrelera fartygsförändringar och neuronal död och att testa farmakologiska terapier för patienter i olika faser av sjukdomen.
Mot bakgrund av ovanstående uttalanden anser vi att erkännande och kvantifiering av vaskulär förändringar är grundläggande i retinopathies studier. I detta arbete kommer vi att visa hur man mäter olika kärlparametrar. För att göra det kommer vi att använda två djurmodeller. En av dem är den syreinducerade retinopatimusen model12, som efterliknar retinopati av råttor och vissa aspekter av proliferativ diabetesretinopati13,14. I denna modell kommer vi att mäta avascular områden, neovaskulära områden och dilatation och tortuositet av huvudfartyg. I vårt laboratorium har en metabolisk syndrom (MetS) musmodell utvecklats, vilket inducerar en icke-proliferative retinopathy15. Här kommer vi att utvärdera kärldensitet och förgrening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Djurmodeller av retinopatier är kraftfulla verktyg för att studera kärlutveckling, ombyggnad eller patologisk angiogenes. Framgången för dessa studier inom området beror på enkel tillgång till vävnaden som gör det möjligt att utföra en mängd olika tekniker, vilket ger data från in vivo– och postmortemmöss26,27. Dessutom har stor korrelation hittats mellan in vivo-studier och klinisk analys, vilket ger solid spårbarhet oc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Carlos Mas, María Pilar Crespo och Cecilia Sampedro från CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) för hjälp med konfokal mikroskopi, till Soledad Miró och Victoria Blanco för särskild djurvård och Laura Gatica för histologisk hjälp. Vi tackar också Victor Diaz (pro-sekreterare för institutionell kommunikation i FCQ) för videoproduktion och utgåva och Paul Hobson för hans kritiska läsning och språkrevision av manuskriptet.
Denna artikel finansierades genom bidrag från Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alla till M.C.S.).
Materials
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
Referências
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
- Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164 (2019).
- Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369 (2021).
- Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
- Lechner, J., O’Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
- Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
- Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
- Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
- Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987 (2020).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362 (2016).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
- Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
- Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
- Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
- Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916 (2018).
- Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
- Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835 (2021).
- Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
- Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).
