Este protocolo descreve a dinâmica das infecções virais usando recombinação expressante (r)SARS-CoV-2 e um sistema de imagem in vivo (IVIS) em camundongos transgênicos K18 hACE2 para superar a necessidade de abordagens secundárias necessárias para estudar infecções sars-cov-2 in vivo.
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Artigo de método
Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pandemia da doença coronavírus 2019 (COVID-19) foi causada por síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Até o momento, o SARS-CoV-2 foi responsável por mais de 242 milhões de infecções e mais de 4,9 milhões de mortes em todo o mundo. Semelhante a outros vírus, estudar o SARS-CoV-2 requer o uso de métodos experimentais para detectar a presença de vírus em células infectadas e/ou em modelos animais. Para superar essa limitação, geramos proteínas recombinantes competentes para replicação (r)SARS-CoV-2 que expressa proteínas bioluminescentes (nanoluciferase, Nluc) ou fluorescentes (Vênus). Estes rSARS-CoV-2 que expressam repórteres permitem rastrear infecções virais in vitro e in vivo com base na expressão dos genes de repórteres de Nluc e Vênus. Aqui, o estudo descreve o uso de rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus para detectar e rastrear a infecção pelo SARS-CoV-2 no modelo de infecção transgênica K18(IVIS) da enzima de conversão de angiotensina humana anteriormente descrita. Este rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostram rSARS-CoV-2/WT-like patogenicidade e replicação viral in vivo. É importante ressaltar que a expressão de Niuc e Vênus nos permite rastrear diretamente infecções virais in vivo e ex vivo, em camundongos infectados. Estes rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus representam uma excelente opção para estudar a biologia do SARS-CoV-2 in vivo, para entender a infecção viral e a doença COVID-19 associada, e identificar tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos eficazes para combater a infecção pelo SARS-CoV-2.
Introdução
Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) é um vírus RNA envolto, de sentido positivo e de uma única cadeia que pertence à linhagem Betacoronavírus na família Coronaviridae 1. Esta família viral é dividida em Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Alfa e Betacoronavírus infectam principalmente mamíferos, enquanto Gamma e Deltacoronavirus infectam quase exclusivamente aves2. Até o momento, sete coronavírus (CoV) cruzaram barreiras de espécies e emergiram como coronavírus humanos (HCoV): dois alfa-CoVs (HCoV-229E e HCoV-NL63) e cinco beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1,....
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Protocolo
Protocolos envolvendo camundongos transgênicos K18 hACE2 foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) do Texas Biomedical Research Institute (TBRI) e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os experimentos seguem as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa40. Os EPI (Personal Protection Equipment, equipamento de proteção individual) apropriados para trabalhar com camundongos.
1. Uso de camundongos transgênicos K18 hACE2
- Compre e mantenha camundongos B6.Cg-Tg femininos de 4-6 semanas de....
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Resultados
rSARS-CoV-2/Infecção por Niuc em camundongos transgênicos K18 hACE2 (Figuras 1 e 2)
A Figura 1A mostra uma representação esquemática do rSARS-CoV-2/WT (superior) e rSARS-CoV-2/Nluc (inferior) utilizado para avaliar infecções in vivo. A Figura 1B mostra o fluxograma esquemático aplicado para avaliar a dinâmica da infecção rSARS-CoV-2/Nluc em camundongos transgênicos K18 hACE2. Camundongos.......
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Discussão
Este protocolo demonstra a viabilidade do uso desses rSARS-CoV-2 expressando genes repórteres para monitorar infecções virais in vivo. Ambos os vírus recombinantes que expressam repórteres fornecem uma excelente ferramenta para estudar infecções pelo SARS-CoV-2 in vivo. Os sistemas de imagem ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) representam uma excelente opção para entender a dinâmica da infecção pelo SARS-CoV-2, a patogênese viral e identificar células/órgãos infect.......
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Divulgações
Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de qualquer conflito comercial, financeiro e não financeiro ou pessoal de interesse em relação ao trabalho descrito.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos membros do nosso instituto (Texas Biomedical Research Institute) por seus esforços em manter nossas instalações totalmente operacionais e seguras durante a pandemia COVID-19. Gostaríamos também de agradecer ao nosso Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) e ao Feitiço (IACUC) por revisar nossos protocolos de forma eficiente. Agradecemos ao Dr. Thomas Moran da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai por fornecer o anticorpo monoclonal de proteína sars-CoV 1C7C7 (N) proteína. A pesquisa SARS-CoV-2 no laboratório de Martinez-Sobrido é atualmente apoiada pelas bolsas NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 e R43AI165089-01; o Departamen....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Armazenar em temperatura ambiente (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Solução de formalina, tamponado neutro | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| Placa de cultura de células de 24 poços | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% de bicarbonato de sódio | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| Placa de cultura de células de 6 poços | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Placa de cultura de células de 96 poços | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Células epiteliais de rim de macaco verde africano (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Software de imagem 3.2.0 | Spectral Instruments Software | de análise de imagem | |
| Albumina de soro bovino (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Armazenar em 4 ° |
| C Água de grau de cultura de células | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco' s Águia modificada' s médio (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Loja em 4 ° C |
| Máquina de gás de anestesia | Sistemas de anestesia veterinária, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Soro Bovino (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Armazenar a -20 ° C |
| Camundongos transgênicos K18-hACE2 fêmeas de quatro a seis semanas de idade | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Versão 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurano | Baxter | 1001936040 | Loja na RT |
| Software de Análise de Dados MARS | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Loja na RT |
| Promega | N1110 | do ensaio de Nano-Glo Luciferase | Este reagente é usado para medir a atividade de Nluc. Armazene a -20 > C |
| Nunc MicroWell MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Armazene em -20 ° C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogeneizador | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Homogeneização de tecidos moles CK14 - 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Kit Vector Laboratories | PK-4002 | ABC e kit de substrato de peroxidase DAB |
Referências
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
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Reimpressões e permissões
