Создание мышиной модели тяжелого острого панкреатита с использованием ретроградной инъекции таурохолата натрия в билиопанкреатический проток
Summary
В настоящем описана мышиная модель тяжелого острого панкреатита. Процедура, представленная здесь, очень быстрая, простая и доступная, что потенциально позволяет изучать молекулярные механизмы и различные терапевтические вмешательства при остром панкреатите удобным способом.
Abstract
Распространенность острого панкреатита (АП), особенно тяжелого острого панкреатита (САП), ежегодно увеличивается в младших возрастных группах. Однако в современной клинической практике не хватает эффективных методов лечения. Благодаря легкой доступности трансгенных и нокаутных штаммов и их небольшому размеру, что позволяет использовать минимальные дозы препаратов, необходимых для оценки in vivo , для исследования АП предпочтительна хорошо зарекомендовавшая себя экспериментальная модель на мышах. Кроме того, SAP, индуцированный с помощью таурохолата натрия (TC), в настоящее время является одной из наиболее широко используемых и наиболее характеризуемых моделей. Эта модель была исследована для новых методов лечения и возможных молекулярных событий во время процесса AP. Здесь мы представляем поколение модели мыши AP с использованием таурохолата натрия и простого самодельного микрошприца. Кроме того, мы также предоставляем методологию для последующего гистологического и серологического тестирования.
Introduction
Острый панкреатит (АП) – острое воспаление поджелудочной железы, характеризующееся обструкцией главного протока поджелудочной железы с последующим растяжением протоков и аутоперевариванием поджелудочной железы ее аномально активированными ферментами. Его клинические проявления включают местное или системное воспаление, боль в животе и повышение уровня амилазы в сыворотке крови1,2. Согласно классификации тяжести3, АП может присутствовать в легких, умеренных и тяжелых формах, и среди них тяжелый острый панкреатит (САП) является наиболее тревожным состоянием из-за его высокой смертности более 30%4. В Соединенных Штатах AP является одной из наиболее распространенных причин госпитализации, затрагивающей более 200 000 пациентов5. Кроме того, АП, особенно САП, ежегодно увеличивается и затрагивает младшие возрастные группы6. Однако в современной клинической практике отсутствуют эффективные варианты лечения6,7. Поэтому необходимо исследовать молекулярные механизмы, участвующие в АП, тем самым способствуя улучшению лечения.
Хорошо зарекомендовавшие себя экспериментальные модели на животных необходимы для изучения механизмов, участвующих в АП, и оценки эффективности различных методов лечения. Благодаря легкой доступности трансгенных и нокаутных штаммов и их небольшому размеру, что сводит к минимуму дозы препаратов, необходимых для оценки in vivo, мыши предпочтительны для исследования AP. Поэтому на мышах было разработано несколько моделей АП8,9.
Работая с моделью крыс с легким панкреатитом, индуцированной путем внутривенного введения caerulein10, Niederau et al. разработали модель мыши SAP, представленную с некрозом ацинарных клеток, индуцированным с использованием того же препарата и инъекционного маршрута11. Хотя эта модель обладает рядом преимуществ, включая неинвазивность, быструю индукцию, широкую воспроизводимость и применимость, основным недостатком является то, что в большинстве случаев развивается только легкая форма АП, тем самым ограничивая ее клиническую значимость. Алкоголь считается одним из основных этиологических факторов АП; Однако Foitzik et al. сообщили, что он вызывает повреждение поджелудочной железы только в сочетании с другими факторами, такими как экзокринная гиперстимуляция12. Более того, хотя модели АП, индуцированные алкоголем, разработанные с помощью различных путей введения, и дозы лекарств были зарегистрированы13,14,15, их основным недостатком является трудность их воспроизведения. Внутрибрюшинное введение L-аргинина также может индуцировать AP у мышей16; однако его низкая клиническая значимость препятствует его применению. Таурохолат, желчная соль, был впервые предложен Creutzfeld et al. в 1965 году для индуцирования состояния, напоминающего человеческий AP, посредством инфузии протоков поджелудочной железы17. Хотя существуют споры относительно его клинической значимости в патофизиологии18,19, панкреатит, вызванный таурохолатом, остается незаменимой моделью для SAP.
Поскольку эта модель проста в реализации, а также эффективна на мышах, в настоящее время она является одной из наиболее часто используемых моделей AP для исследований на мелких животных in vivo. Perides et al. использовали таурохолат натрия (TC) для индуцирования SAP у мышей20, предоставляя понимание для понимания его патологии. В сочетании с методами генетической модификации эта модель позволила нам подтвердить несколько конкретных генов, участвующих в AP. Например, Bicozo et al. показали, что нокаут гена CD38 защищает от модели панкреатита TC-инфузии и приписывает механизмы изменениям во внутриклеточной передаче сигналов Ca2+21. Fanczal et al. исследовали физиологическое значение экспрессии TRPM2 в плазматической мембране ацинарных и протоковых клеток поджелудочной железы мыши и продемонстрировали снижение тяжести TC-индуцированного SAP у нокаутирующих мышей TRPM22. Кроме того, эта модель также обеспечивает простой и эффективный способ тестирования многих новых лекарств in vivo. Например, этот метод позволил валидировать терапевтические эффекты кофеина23, дегидрохолевой кислоты24 и различных антиоксидантов и антикоагулянтов25,26. Эти данные демонстрируют универсальность модели SAP, индуцированной TC. Хотя Wittel et al. описали аналогичную модель мыши27, отсутствие подробностей о процедурах реализации может привести к невозможности воспроизвести результаты. В этой статье мы сосредоточимся на методах с использованием простого самодельного микрошприца и исследуем TC-индуцированный SAP, тем самым предоставляя возможное руководство не только для дальнейшего изучения патогенеза и лечения АП, но и для идеально адаптируемого экспериментального метода для многих других веществ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модель SAP, индуцированная TC, является отличным инструментом исследования. Как показано в этом исследовании, эта модель очень легко реализуется в общих лабораториях без использования конкретных устройств. При использовании в сочетании с гистологическим и биохимическим анализом он обе?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за поддержку со стороны следующих грантов: грант на трансляционные исследования NCRCH [2020WSA01], научный грант KJXW от Комиссии по здравоохранению Сучжоу для молодых ученых [KJXW2020002], План науки и техники города Сучжоу (SKY2021038 и SKJY2021050), грант от Приоритетной академической программы развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD) и План первичных исследований и социального развития провинции Цзянсу (BE2018659).
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
Referências
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227 (2019).
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
