Et tredobbelt kulturcellesystem, der modellerer den menneskelige blod-hjerne-barriere

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at etablere en human blod-hjerne barriere (BBB) in vitro model. Endotelcellerne og pericytterne er podet på hver side af et indsatsfilter (blodrum), og astrocytter er podet i bundbrønden (hjernerummet). Den karakteriserede model blev brugt til nanopartikler transporteksperimenter.

Abstract

Levering af lægemidler til hjernen er fortsat en udfordring på grund af blod-hjerne-barrierens (BBB) meget specifikke og restriktive egenskaber, som styrer og begrænser adgangen til hjernens parenchyma. Men med udviklingen af nanoteknologi blev der udviklet store paneler af nye nanomaterialer for at forbedre lægemiddelafgivelsen, hvilket understreger behovet for pålidelige in vitro-mikrosystemer til at forudsige hjerneindtrængning inden for rammerne af prækliniske assays. Her er en ligetil metode til at oprette et mikrofysiologisk system til at modellere BBB ved udelukkende at bruge humane celler. I sin konfiguration består modellen af en tredobbelt kultur, herunder hjernelignende endotelceller (BLEC’er), pericytter og astrocytter, de tre vigtigste BBB-cellulære aktører, der er nødvendige for at inducere og regulere BBB-egenskaberne på en mere fysiologisk måde uden krav om stramningsforbindelser. Modellen udviklet i et 12-brønds pladeformat, klar efter 6 dages tredobbelt kultur, er karakteriseret i fysiske egenskaber, gen- og proteinudtryk og anvendes til polymer nanogeltransportmåling. Modellen kan bruges til en lang række eksperimenter under sunde og patologiske forhold og repræsenterer et værdifuldt værktøj til prækliniske vurderinger af molekyle- og partikeltransport samt inter- og intracellulær handel.

Introduction

BBB, lokaliseret på niveau med hjernekapillærendotelceller (EC’er), kontrollerer og regulerer adgangen til hjernens parenchyma, hvilket er afgørende for at opretholde hjernens homeostase og funktionen af neurale celler ^1,2. Men i tilfælde af hjernepatologi udgør manglen på adgang til hjernens parenchyma en reel hindring for at udvikle terapeutiske strategier.

BBB EC’erne har et komplekst sæt egenskaber, herunder TJ-proteiner (tight junction), som forsegler det intercellulære rum, der er forbundet med et system af udstrømningspumper, specifikke transportører og receptorer, som styrer den transcellulære vej ^1,2,3. Desuden induceres og vedligeholdes alle disse egenskaber takket være kommunikation med pericytterne indlejret i BBB EC-kældermembranen og astrocytterne, hvis endefødder omgiver hjernekapillærerne ^1,2,3. Derfor er det en udfordring at studere BBB in vitro i betragtning af kompleksiteten af dens arkitektur og kommunikationen mellem de forskellige celletyper, der udgør den neurovaskulære enhed (NVU)². Desuden er de forskellige celletyper afgørende for induktion og vedligeholdelse af BBB-egenskaber og påvirker følgelig forudsigelsen af krydsningen gennem BBB. Forskellige strategier for lægemiddellevering til hjernen blev allerede testet ved hjælp af et stort panel af taktikker for at omgå BBB-begrænsede egenskaber⁴. På det seneste er der med nanoteknologiens fremskridt ved at blive udviklet nye materialer til anvendelser som lægemiddelbærere ^5,6. Ud over deres højere belastning, reducerede toksicitet og øgede lægemidlers biotilgængelighed kan disse nye nanomaterialer funktionaliseres til en trojansk heststrategi for at krydse BBB og specifikt målrette celler i parenchymen ^5,6. Blandt de forskellige typer nanomaterialer, der evalueres, har nanogeler tiltrukket sig betydelig opmærksomhed, hovedsageligt på grund af deres kolloide egenskaber og evne til at skræddersy den kemiske struktur til at introducere stimuli-responsive egenskaber 7,8,9,10,11,12,13,14,15.

In vitro-modeller er nu udviklet til prækliniske undersøgelser, hvor man bruger humane celler til at forudsige hjernens penetration af lægemidler¹⁶. Forskellige indstillinger af disse modeller er tilgængelige, fra monolag af hjerne-EC’er til flere cellesystemer¹⁶. I betragtning af NVU-cellernes betydning i BBB-induktion og vedligeholdelse og det koordinerede respons på det patologiske miljø skal BBB in vitro-modeller overveje alle disse hovedpersoner for at forbedre relevansen af forudsigelsen ^2,17.

Den nuværende metode beskriver opsætning af en tredobbelt kultur in vitro-model af den humane BBB, som er fuldt udviklet med humane celler til at studere specifikke cellulære og humane molekylære mekanismer. For at være fysiologisk relevant består modellen af BBB’s tre vigtigste cellulære aktører (EC’er, pericytter og astrocytter), der er nødvendige for at inducere og vedligeholde BBB-egenskaberne uden brug af tilspændingsforbindelser og viser et sæt egenskaber, der kræves for at blive betragtet som en in vitro BBB-model^16,18. Modellen er opstillet i en konfiguration, der afgrænser blod- og hjernerummet, og som er egnet til prækliniske undersøgelser af lægemiddel- og partikeltransport for at forudsige hjernens penetration. Modellens anvendelighed illustreres ved at måle transporten af polymere nanogeler.

Protocol

Protokollen blev godkendt af det franske ministerium for videregående uddannelse og forskning (reference: CODECOH DC2011-1321) og af det lokale undersøgelsesudvalg (Béthune Maternity Hospital, Beuvry, Frankrig). For at opnå endotelcellerne (EC’er) blev der opnået skriftligt og informeret samtykke fra donorens forældre til at indsamle navlesnorsblod i overensstemmelse med den franske lovgivning. Pericytterne leveres af professor Takashi Kanda (Institut for Neurologi og Klinisk Neurovidenskab, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Japan), der blev isoleret i henhold til reference19. Primære menneskelige hjernebarkastrocytter købes hos en kommerciel udbyder (se Materialetabel). 1. Cellekultur Dyrkning af endotelcellerBEMÆRK: Endotelceller (EC’er) er afledt af CD34+ hæmatopoietiske stamceller isoleret fra humant navlestrengsblod i henhold til metoden beskrevet af Pedroso et al.20. EC’ernes endotelfænotype er beskrevet i Pedroso et al.20. Dyrk humane EC’er ved hjælp af endotelcellemedium suppleret med 5% føtalt kalveserum (FCS), 0,5% gentamicin og 1% endotelcellevæksttilskud (ECM) (se materialetabel). For subkulturerende EC’er, to dage før indstillingen af modellen, skal du belægge en skål med 10 ml 2% gelatine i 15 minutter ved 37 ° C og derefter erstatte den med 20 ml varm ECM. Optø et hætteglas med EC’er indeholdende 1 million celler (celler blev manuelt talt som beskrevet i trin 2.3.3 før cellefrysning) i den præovertrukne cellekulturskål. Efter 3 timer ved 37 °C fornyes mediet, og cellerne opretholdes, indtil trikulturen indstilles i en befugtet atmosfære inde i en inkubator ved 37 °C under 5 % CO2 og 21 %O2. Dyrkning af pericytterBEMÆRK: Perikytterne isoleres fra den menneskelige hjerne i henhold til protokollen offentliggjort af Shimizu et al.19, hvis isolationsprocedure følger metoden offentliggjort af Kanda et al.21 med modifikationer.Dyrk pericytterne ved hjælp af Dulbeccos modificerede Eagle-medium suppleret med 4,5 g / L glucose (DMEM HG), 10% FCS, 1% de penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin (se Materialetabel). Til pericyt-subkulturering skal to retter med 8 ml / skål med 100 μg / ml kollagen type I-opløsning i 0,02 N eddikesyre i 1 time ved stuetemperatur (RT) fem dage før indstillingen af modellen overtrækkes og vaskes derefter to gange med RT DMEM HG. Optø et hætteglas med pericytter indeholdende 1 million celler i et konisk rør indeholdende 10 ml varmt medium og centrifugerer suspensionen i 5 minutter ved 190 x g ved 20 °C. Resuspender pelleten i 10 ml varmt medium og frø i de forovertrukne cellekulturretter, der er fyldt med 15 ml varmt medium / fad. Substratet fornyes efter 3 dage, og cellerne opretholdes indtil indstillingen af trikulturen i en befugtet inkubator ved 37 °C under 5% CO2 og 21%O2. Dyrkning af astrocytterDyrk astrocytterne ved hjælp af et astrocytmedium suppleret med 20% FCS, 1% af astrocytvæksttilskud og 1% penicillin / streptomycinopløsning (AM) (se materialetabel). Til subkulturering af astrocytterne skal man en uge før modellens indstilling belægge en T75-cellekulturkolbe med 10 ml 2 μg/cm2 poly-L-lysin (PLL) i 1 time ved 37 °C og vaskes to gange med RT-sterilt vand. Optø et hætteglas med astrocytter indeholdende 1 million celler i 20 ml varmt medium og frø i den præovertrukne T75-cellekulturkolbe.BEMÆRK: De kommercielt opnåede cellehætteglas bekræfter tilstedeværelsen af ~ 1 million celler, så tællingen af celler blev ikke udført her. Cellerne opbevares i en befugtet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2 og 21 %O2. Mediet fornyes efter 24 timer og derefter hver 2. dag indtil indstillingen af trikulturen. 2. Indstilling af tredobbelt kulturmodel BEMÆRK: Samlingen af de tre celletyper udføres samme dag. Dagen før indstillingen af trikulturen skal du udføre kollagen type I-belægningen på de tilbageførte indsatsfiltre (se Materialetabel) og så astrocytterne i de PLL-præcoated brønde på en 12-brøndsplade. Såning af astrocytter i brøndeneBrøndene belægges med 500 μL 2 μg/cm 2 PLL-opløsning som beskrevet i trin 1.3.2. Cellerne vaskes én gang med 10 ml varmt fosfatbuffersaltvand – calcium- og magnesiumfri 1X (1X PBS-CMF) (tabel 1), inden de inkuberes i 3 minutter ved 37 °C med 10 ml varm 20% trypsin/EDTA (T/E)-opløsning, og cellerne fjernes mekanisk fra kolben. Overfør suspensionen til et konisk rør indeholdende 5 ml varm ikke-fortyndet FCS.BEMÆRK: I henhold til udbyderens protokol22 kan samlingen af astrocytter optimeres ved at placere kolben i inkubatoren i 1 minut og trykke på kolben for at hjælpe med at fuldføre løsrivelsen. De resterende celler skal opsamles med 5 ml T / E-neutraliseringsopløsning og anbringes i det FCS-holdige koniske rør. Centrifuger suspensionen i 5 minutter ved 20 °C ved 190 x g. Resuspender cellepelleten i 5 ml varm AM. Cellerne tælles ved at fortynde 20 μL af cellesuspensionen i 80 μL 1X PBS-CMF ved hjælp af et manuelt tællekammer under et mikroskop (se Materialetabel). Plade omkring 40.000 celler/cm2 i hver PLL-forcoated brønd i et volumen på 1,5 ml varm AM. Såning af pericytter på de tilbageførte indsatsfiltreDer tilsættes 250 μL kollagen type I-opløsning (100 μg/ml) på de tilbageførte indsatsfiltre, anbragt i periferien af en overdækket 25 mm høj skål (se Materialetabel) ved hjælp af steril pincet. Lad belægningen stå i 1 time ved RT under sterile forhold.BEMÆRK: Den brugte skål skal være høj nok til at sikre opretholdelse af sterilitet, når den er uden for emhætten og undgå kontakt mellem opløsningerne på det tilbageførte filter og skålens dæksel. Fjern omhyggeligt kollagen type I-opløsningen med en glaspipette forbundet til et aspirationssystem. Vask to gange med 250 μL RT DMEM HG, og fjern derefter forsigtigt al opløsningen fra indsatsfiltrene. Lad de belagte indsatsfiltre stå ved RT under sterile forhold indtil podning af cellerne.BEMÆRK: Under belægningsproceduren skal du passe på ikke at røre ved filteret for at undgå membranskader. Når de er belagt med kollagen type I, kan indsatsfiltrene opbevares natten over på RT. På dagen for trikulturindstillingen vaskes pericytterne to gange med 10 ml varm 1X PBS-CMF og inkuberes cellerne med 2 ml varm trypsin. Overvåg virkningen af trypsin ved at observere cellerne under mikroskopet. Når cellerne begynder at løsne sig, skal du fjerne trypsinen og tilføje 5 ml varm ECM før mekanisk dissociation. Cellerne tælles ved at fortynde 20 μL af cellesuspensionen i 80 μL 1X PBS-CMF ved hjælp af et manuelt tællekammer under et mikroskop, og der sås 44.500 celler/cm2 på de præbelagte tilbageførte indsatsfiltre i et volumen på 250 μL. Indsatsfiltrene opbevares i en befugtet inkubator ved 37 °C i 3 timer under 5 % CO2 og 21 %O2. Vend forsigtigt indsatsfiltrene tilbage ved hjælp af en steril pincet i en 12-brønds plade, der indeholder 1,5 ml varm ECM / brønd. Indsatsfiltrene er nu klar til at blive belagt på den anden side. Såning af endotelceller på indsatsfiltreneOversiden af skærfiltrene belægges med 500 μL ekstracellulær matrixbaseret hydrogel (1/48 v/v) (se Materialetabel). Efter 1 time vaskes en gang med 5 μL RT DMEM HG I EN BEFUGTET INKUBATOR VED 37 °C under 5 % CO2 og 21 %O2. Vask en gang med 10 ml varm 1X PBS-CMF og inkuber cellerne med 2 ml varm trypsin. Når cellerne begynder at løsne sig, skal du fjerne trypsinen og tilføje 5 ml varm ECM før mekanisk dissociation. Cellerne tælles ved at fortynde 20 μL af cellesuspensionen i 80 μL 1X PBS-CMF ved hjælp af et manuelt tællekammer under mikroskop og frø EC’erne med en densitet på 71.500 celler / cm2 på de forovertrukne indsatsfiltre i et volumen på 500 μL varm ECM. Udskift AM med 1,5 ml varm ECM/brønd, og overfør derefter de podede indsatsfiltre (EC’er + pericytter) på brøndene, der indeholder astrocytterne. Trikulturcellesystemerne anbringes i en befugtet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2 og 21 %O2. Vedligeholdelse af den tredobbelte cellekultur til induktion af BBB-egenskaberneBEMÆRK: Til induktion af BBB-egenskaberne i EC’erne er 6 dages tredobbelt kultur nødvendig.Forny mediet hver anden dag indtil dag 6, og tag forsigtigt mediet ud af det øverste og nederste rum ved hjælp af en glaspipette, der er forbundet med et aspirationssystem. Udskift hurtigt med varm ECM i et volumen på 500 μL i det øverste rum og 1,5 ml i det nederste rum, og sæt cellerne tilbage i en befugtet inkubator ved 37 °C under 5% CO 2 og 21% O2. 3. BBB fænotype validering BEMÆRK: Efter 6 dages tredobbelt kultur, den tid, der er nødvendig for at inducere BBB-fænotypen i EC’erne, er den menneskelige BBB-model klar til eksperimenter. Den fysiske integritet af de hjernelignende endotelceller (BLEC’er) visualiseres ved immunfluorescensfarvning af TJ-proteiner evalueret ved hjælp af permeabilitetsassay til BBB-integritetsmarkører. BBB-fænotypevalideringen omfatter også gener/proteinekspressionsanalyse og effluxpumpers funktionalitet i henhold til proceduren beskrevet i Deligne et al.,23. Pericytter og astrocytter visualiseres af respektive farvningsmarkører i henhold til proceduren beskrevet i Deligne et al. 202023. Immunofluorescens farvningFastgør indsatsfiltre og astrocytter i iskold methanol/acetone (50/50 v/v) i 1 min., og vask to gange med RT 1X PBS-CMF. Adskil forsigtigt filteret fra indsatsen ved at skære membranen ved hjælp af en skalpel. Udfør immuncytokemi på membranen og bundbrøndene i henhold til Deligne et al.23.BEMÆRK: Til blokeringstrinnet skal du bruge 250 μL SEA BLOCK Blocking buffer (se Materialetabel) i 30 minutter ved RT. BBB integritet assayVurder BLEC’ernes fysiske integritet ved hjælp af et permeabilitetsassay ved hjælp af BBB-integritetsmarkører med forskellige molekylvægte, som natriumfluorescein (NaF) og 20 kDa Dextran (FD20) (se materialetabel).BEMÆRK: Eksperimentet kan udføres i henhold til proceduren beskrevet i Deligne et al.23. Efflux pumpe funktionalitetVurder funktionaliteten af P-glycoprotein (P-gp) og brystkræftresistensprotein (BCRP) ved at måle den intracellulære ophobning af Rhodamin 123 (R123) med og uden Elacridar, en P-gp og BCRP-hæmmer (se Materialetabel).BEMÆRK: Eksperimentet kan udføres i henhold til proceduren beskrevet i Deligne et al.23. Gen- og proteinekspressionerUdfør gen- og proteinprøveindsamling på is efter en hurtig vask med kolde Ringer HEPES (RH) (tabel 1) af cellerne. Inden EC-prøveindsamling skrabes pericytterne af de omvendte indsatsfiltre20. 4. Nanogel transport BEMÆRK: For at estimere passagen af polymere nanogeler (NG’er) fra luminal- til abluminalrummet i triculture BLIC-modellen blev 0,1 mg / ml NG-opløsning tilsat på dag 6 på luminalrummet i 24 timer. Undersøgte NG’er var fluorescerende mærkede N-isopropylacrylamid (NIPAM)-baserede hydrogeler med en gennemsnitlig størrelse på 8-10 nm (se Materialetabel). Nanogelpulveret vejes og opløses i ECM i en koncentration på 1 mg/ml. Soniker opløsningen i 10 minutter og filtrer ved hjælp af et 0,2 μm PTFE-filter.BEMÆRK: Forbered en frisk NG-opløsning dagen for eksperimentet. Mediet i luminalrummet ændres, og der tilsættes 50 μL NGs-opløsning i det øverste rum for en slutkoncentration på 0,1 mg/ml.BEMÆRK: Udfør en fortynding på 1:10 fra den oprindelige opløsning. Efter 24 timers inkubation samles aliquoter fra luminale (20 μL) og abluminale (200 μL) rum og placeres i en sort 96-brøndplade. Kvantificer fluorescensen ved hjælp af en fluorescerende multiplatlæser (se Materialetabel) med en sort 96-brøndplade ved hjælp af indstillingen af excitations- / emissionsbølgelængder ved 477/540 nm. Beregn den procentdel af krydsningen, der henvises til den oprindelige arbejdsløsning, der er tilføjet på det tidspunkt = 0 h (t0)6,15.BEMÆRK: For at forberede 96-brøndspladen til fluorescensmålingen tilsættes 200 μL opløsning fra abluminalrummet og 20 μL opløsning fra luminalrummet og t0-præparatet (tilsæt 180 μL ECM for at nå et endeligt volumen på 200 μL). Medtag også en kalibreringskurve og et tomt felt til læsepladen. Instrumentelle parametre: Detektionsmetode – Fluorescens, Optisk position – Top, Læsetype – Slutpunkt, Excitationsbølgelængde – 477 nm, Emissionsbølgelængde – 540 nm, Følsomhed – 100, Ryst – Dobbelt orbital i 5 s.

Representative Results

Indstilling af den menneskelige tredobbelte kultur BBB-modelDen protokol, der kræves til indstilling af den menneskelige BBB in vitro-model , er beskrevet i figur 1 og omfatter successive trin, hvis rækkefølge skal overholdes nøje. Først dyrkes de tre celletyper individuelt i cellekulturskåle (figur 1A), inden de samles i et indsatsfiltersystem. Den tredobbelte kulturindstilling begynder med såning af den første celletype, astrocytter, i den præ-coatede bundbrønd. Den følgende dag podes pericytter og EC’er på indsatsfilterets forbelagte henholdsvis abluminale og luminale overflader. Indsatsfilteret overføres derefter over astrocytterne. Modellen opretholdes i kultur i 6 dage, den tid, der er nødvendig for at inducere BBB-egenskaberne i EC’er, med en fornyelse af medium hver anden dag i henhold til den patenterede co-kulturmodel24. EC’erne omdøbes derefter til BLEC’er (figur 1B). Karakterisering af den menneskelige BBB-modelDen tredobbelte cellekulturmodel er blevet karakteriseret for tilstedeværelsen af et sæt BBB-specifikke egenskaber. Først og fremmest bekræftede immunocytokemiske data ekspressionen af konventionelle markører såsom blodpladeafledt vækstfaktorreceptor β (PDGFR-β)25,26 og desmin for pericytter og glialfibrillært surt protein (GFAP)26 for astrocytter (figur 2A). Efter de 6 dages kultur med pericytter og astrocytter viser monolaget af BLEC’er, visualiseret med den vedhæftede krydsfarvning af VE-Cadherin, en kontinuerlig lokalisering af TJ-proteiner, Claudin-5 og ZO-1, ved cellegrænserne (figur 2A). Opsætningen af TJ’erne er korreleret med lave paracellulære permeabilitetskoefficienter målt ved hjælp af BBB-integritetsmarkører med lav molekylvægt, dvs. NaF (376 Da)16,27 og høj molekylvægt, dvs. FD20 (20 kDa)27, som vist i figur 2B. De målte værdier er sammenlignelige med validerede BBB in vitro-modeller, der anvender den nøjagtige kilde til ECs23,24,28. Alt i alt fremhæver disse resultater den lave paracellulære permeabilitet af det tredobbelte kultur BLEC-monolag, som er karakteristisk for in vivo BBB. Derudover udviste R123 intracellulær akkumulering i BLEC’er en signifikant stigning i tilstedeværelsen af udstrømningspumpehæmmeren Elacridar 23,24 sammenlignet med kontroltilstanden med dens fravær (figur 2C). Dette indikerer tilstedeværelsen af aktive udstrømningspumpemolekyler, nemlig P-gp og BCRP, i BLEC’erne. For yderligere at karakterisere BLEC’erne blev genekspression og proteinniveau for vigtige BBB-funktioner undersøgt (figur 3). De data, der blev opnået med triple culture-modellen, blev sammenlignet med den validerede og patenterede samkulturmodel bestående af EC’er og pericytter24 , der blev brugt som kontrolmodel. Astrocytterne repræsenterer den tredje celletype, der er tilføjet i den oprindelige co-kulturmodel i triple culture-modellen. Derfor viste genekspressionsanalysen (figur 3A) af tredobbelte kultur-BLAC’er sammenlignet med co-kultur BLEC’er opretholdelsen af ekspression af vigtige BBB-funktioner såsom TJ-proteiner (claudin-5 og zonula occludens-1) og effluxpumper (P-gp og BCRP) og opregulering af de fleste undersøgte BBB-transportører (glucosetransportør 1) og receptorer (transferrinreceptor). Proteinkvantificeringsdata (figur 3B) viste sig at være i overensstemmelse med transkriptionsresultaterne. Samlet set understøtter disse data den positive induktion af BBB-egenskaber i det tredobbelte kultur-BLIC-lag svarende til den validerede co-kulturmodel. Alt i alt viser den tredobbelte kulturmodel de nødvendige fysiske og metaboliske egenskaber for et in vitro mikrofysiologisk system til modellering af BBB. Anvendelighed på lægemiddelleveringsstrategier – måling af nanogeltransportFor at vurdere muligheden for at bruge triple culture-modellen til at studere nye hjerneleveringsstrategier blev transporten af fluorescerende mærkede NIPAM-baserede neutrale NG’er evalueret 6,15. På tidspunktet 0 blev NG’er anbragt i luminalrummet i en koncentration på 0,1 mg / ml (figur 4A). Efter 24 timers inkubation blev 5,82% af NG’erne fundet i det abluminale rum (figur 4B), hvilket beviste deres evne til at krydse BLEC’erne. Resultaterne viser modellens egnethed til at måle permeabiliteten af små og større forbindelser, som beskrevet med integritetsmarkørerne, og evaluere transporten af nanomaterialer såsom polymere NG’er. Figur 1: Repræsentation af kritiske trin til indstilling af den tredobbelte kultur in vitro-model af den humane BBB. (A) Fasekontrastbilleder af de tre cellekomponenter i BBB-modellen: endotelceller (EC), pericytter (PC) og astrocytter (AC). Skala bar = 250 μm. (B) Skematisk og illustrativ tidslinje for indstilling af den tredobbelte kultur menneskelige BBB in vitro-model. Den fremhævede boks repræsenterer belægningsproceduren for det omvendte indsatsfilter. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Vurdering af egenskaberne ved BBB-modellen med tredobbelt kultur. (A) Repræsentative immunostaining-billeder af de karakteristiske markører for BLEC’er (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 og VE-Cadherin: Ve-Cadh), pericytter (blodpladeafledt vækstfaktorreceptor-β: PDGFR-β og desmin) og astrocytter (Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP). Skalabar = 10 μm. (B) Paracellulær permeabilitet af BLEC’er til fluorescerende BBB-integritetsmarkører, natriumfluorescein (NaF, 376 Da, Pe: 0,61 ± 0,062) og FITC-Dextran (FD20, 20 kDa, Pe: 0,04 ± 0,005). N = 3; n = 9. Gennemsnitlig ± SEM. (C) P-gp- og BCRP-funktionalitet i EC’er blev vurderet ved at kvantificere intracellulær R123 med (124,2% ± 3,39%) og uden (100% ± 8,79%) Elacridar. N = 4; n = 12. Gennemsnitlig ± SEM. p = 0,017 ved hjælp af en uparret t-test. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Evaluering af BLIC-genekspression og proteinniveau af karakteristiske markører i triple-kulturmodellen sammenlignet med BBB-modellen for co-kultur. (A) Genekspression af tætte krydsproteiner (Claudin-5: CLD5 og Zona Occludens-1: ZO1), transportører (Glucose Transporter-1: GLUT1, P-glycoprotein: PGP og Breast Cancer Resistance Protein: BCRP) og store molekylereceptorer (Transferrin Receptor: TRFR), normaliseret ved ekspression af RPLP0. N = 3; n = 9. (B) Proteinniveau af tætte forbindelsesproteiner (CLD5 og ZO1), transportører (GLUT1, PGP og BCRP) og store molekylereceptorer (TRFR), normaliseret ved ekspression af β-actin. N = 3; n = 9. Gennemsnitlig ± SEM. For (A) og (B) svarer værdierne>1 til højere genekspressions- eller proteinniveauer i triplekulturmodellen. Den røde linje svarer til en værdi på 1, hvor ekspressionsniveauet (gener eller proteiner) for de to modeller er ækvivalent. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: Måling af nanogeltransport i triple culture-modellen. (A) Skematisk gengivelse af nanogeltransportassayet. (B) Procentdel af nanogeltransport efter 24 timers inkubation i triple culture-modellen (5,82% ± 0,09%). N = 2; n = 6. Betyder ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur. Bufferens navn Sammensætning Seddel Molekylvægt Fosfatbuffersaltvand, calciummagnesiumfri Pbs-CMF NaCl 8 g/l 58.4 Tilsæt al forbindelsen til sterilt vand og vent på fuldstændig opløselighed. pH i den opnåede opløsning skal ligge i området 7,3-7,4. Opløsningen filtreres ved hjælp af en membran på 0,22 μm, og den sterile opløsning opbevares ved 4 °C. KCl 0,2 g/l 74.55 KH2PO4 0,2 g/l 136.09 NaHPO4-12 H2O 2,87 g/l 358.14 Vand Ringer HEPES RH NaCl 8,8 g/l 58.4 Tilsæt hele forbindelsen til sterilt vand og vent på fuldstændig opløsning. PH-værdien justeres til 7,4 (pH-værdi ved startopløsning ca. 6,8). Opløsningen filtreres ved hjælp af en membran på 0,22 μm, og den sterile opløsning opbevares ved 4 °C. KCl 0,387 g/l 74.55 CaCl2 0,244 g/l 110.99 MgCl 2 6H2 O 0,0406 g/l 203.3 NaHCO3 0,504 g/l 84.1 HEPES 1,19 g/l 238.3 Glukose 0,504 g/l 180.16 Vand Tabel 1: Sammensætningen af de forskellige buffere, der anvendes i protokollen.

Discussion

Behandling af hjernesygdomme er fortsat en udfordring i betragtning af lægemidlernes vanskeligheder med at hindre BBB for at nå deres cellulære og molekylære mål i hjernens parenchyma.

Lægemiddeludvikling til hjernesygdomme udviser i øjeblikket en lav succesrate, da de fleste lægemidler, der viser lovende resultater i prækliniske modeller, ikke viste nogen fordel, når de blev brugt i klinikken. I overensstemmelse med “3R-reglen”, der sigter mod at reducere antallet af dyr, der anvendes til forsøg, udvikles in vitro-modeller af BBB til at studere hjernepatologier og forudsige hjerneindtrængning af lægemidler²⁹. In vitro-modeller af BBB er hovedsagelig blevet udviklet ved hjælp af dyreceller og er blevet mere sofistikerede for at forbedre relevansen af de opnåede resultater¹⁶. Et af de betydelige fremskridt i brugen af humane celler, som bringer ubestridelig ny indsigt og mere specificitet på celle- og molekylært niveau til at studere menneskelige sygdomsmekanismer¹⁶. Udviklingen af relevante modeller kræver imidlertid, at man overvejer at forbedre BBB’s in vitro-modelindstillinger og den viden, der opstår, takket være dyremodeller. Derfor skal det overveje kompleksiteten af BBB-arkitekturen og vigtigheden af cellecellekommunikationen for at studere BBB under fysiologiske og patologiske forhold³⁰.

Den protokol, der præsenteres her, beskriver en metode til at oprette en fuld human BBB in vitro-model , der omfatter de tre hovedcelletyper i BBB, uden begrænsning af adgangen til hjernevæv. Som et flercellesystem er induktion og vedligeholdelse af BBB-egenskaber uden kunstig brug af tilspændingsforbindelser, men i stedet induceret af cellecellekommunikation, mere fysiologisk relevant og i overensstemmelse med in vivo-induktionen af BBB-egenskaberne³¹. Derfor er respekten for protokollens kronologi af største betydning for protokollens succes. Desuden repræsenterer inkubationstiderne under indstillingen af den tredobbelte kultur, og når de tre celletyper er samlet, de vigtigste kritiske trin i protokollen.

BBB-egenskaberne i EC’er induceres af co-kulturen med pericytter, som beskrevet for co-kulturmodellen²⁴. Derfor er pericyternes kultur på bagsiden af indsatsfilteret det mest kritiske punkt og kræver nøje at følge protokollen med risiko for ikke at have nok pericytter til induktion af BBB-egenskaberne. Først og fremmest skal man under belægningsproceduren og også cellesåning være opmærksom på ikke at have petriskålens dækning i kontakt med belægningen og også mediet, når cellerne er podet for at sikre en god belægning af filteret og ikke miste celler (trin 2.2.1 og 2.2.4). Når pericytterne er sået, er det desuden vigtigt at vente på det angivne tidspunkt for fastgørelse af pericytterne (trin 2.2.4), før indsatsfilteret vendes tilbage til belægning og såning af EC’er på den anden side (trin 2.2.5 og 2.3). Når de er sået, kræves der seks dage for at inducere BBB-egenskaberne gennem cellecellekommunikation (trin 2.4).

Modellen er valideret med hensyn til begrænset permeabilitet (forbundet med indstillingen af de stramme kryds), da EC’erne i den tredobbelte kulturmodel viser permeabilitetsværdier til BBB-integritetsmarkører svarende til den validerede samkulturmodel og også målt i validerede dyre- eller menneskemodeller 16,27,32. Desuden kræver valideringen af en in vitro BBB-model ud over den begrænsede permeabilitet reaktionsevnen over for andre celletyper i NVU og ekspression af funktionelle receptorer og transportører¹⁶. Derudover er modellen reproducerbar og producerer flere indsatsfiltre og brønde til at udføre adskillige analyser (gen- og proteinekspression, fluorescerende farvning, toksicitetstest) på hver celletype separat uden at kræve en cellesorteringsmetode.

Modellen blev udviklet ved hjælp af et 0,4 μm porestørrelsesfilter til at have en celletype på hver side af indsatsfilteret. Insertfiltersystemet tillod undersøgelse af celle-cellekommunikation under fysiologiske forhold ved at overføre det på velholdige astrocytter. Tilstedeværelsen af astrocytter i systemet repræsenterer en plusværdi sammenlignet med den oprindelige co-kultur in vitro model²⁴. I betragtning af astrocytternes betydning i BBB’s fysiologi tillader denne tredje celletype yderligere forståelse af cellecellekommunikationen inden for BBB. Desuden kan det tredobbelte cellekultursystem også studeres under patologiske tilstande som slagtilfælde, hvor astrocytterne spiller en væsentlig rolle 33,34,35. Derudover kan designet af BLEC’er / pericytter på begge sider af indsatsfilteret let placeres på andre celletyper for at efterligne patologiske tilstande såsom hjernekræft²³.

Porestørrelsen på indsatsfilteret kan medføre begrænsninger med nogle eksperimenter, såsom celletransmigration over BBB. Udviklingen af modellen med en større porestørrelse kræver imidlertid tilpasning af protokollen for at sikre dannelsen af et fysiologisk monolag af EC’er og ikke flere lag, hvilket ikke er fysiologisk relevant for at efterligne BBB³⁶.

Modellens anvendelighed er blevet demonstreret ved hjælp af NGs transporteksperiment, der viser muligheden for at udføre transporteksperiment ved hjælp af et flercellet system. Ikke desto mindre bør man være opmærksom på vanskelighederne ved at have en kontrolforbindelse eller molekyle til transporteksperimentet, der deler sammenlignelige egenskaber med NG’er, da hver nanostruktur udviser et unikt sæt egenskaber (molekylvægt, ladning, form, fysiske egenskaber, proteinkoronadannelse).

En begrænsning af modellen er fraværet af forskydningsspænding, som viste sig at påvirke differentieringen af EC’er og ekspressionen af TJ-proteiner³⁷. Imidlertid er det udfordrende at udvikle et fluidisk system, der efterligner hjernekapillæren i betragtning af kompleksiteten ved at tilføje en fluidisk del, der kræver en bestemt enhed, i et flercellet system. Desuden er den pågældende enhed normalt ikke kommercielt tilgængelig og tillader ikke mange replikater, hvilket gør fluidiske systemer mindre tilpassede til brug med høj kapacitet.

Sammenfattende gengiver dette tredobbelte kultursystem bestående af humane celler in vitro BBB’s arkitektur. Det tillader generering af mange indsatser, der kan bruges til omfattende screening af forbindelser.

Materials

Cell Culture
Astocyte Medium (AM)	ScienCell	1801
Astrocyte Growth Supplement	ScienCell	1852	Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set.
Cell culture dish 100 mm	Corning	430293	100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting
Cell culture dish 150 mm	Corning	430599	The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model.
Collagen I	Corning	354236	Rat tail
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	31600-083	Powder
Endothelial Cell Growth Supplement	ScienCell	1051	Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set.
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell	1001
Fetal Calf Serum	Sigma	F7524
Gelatin	Sigma	G2500	2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF
Gentamicin	BiochromA6	A-2712
Glucose	Sigma	G6152	Powder
Glutamine	Merck	1002891000
Human Brain Cortex Astrocytes	ScienCell	1800-SC
Malassez cell counting chamber	vWR	HECH40453702	The count was performed manually.
Matrigel	Corning	354230	Extracellular matrix-based hydrogel
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	0503	Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets.
Poly-L-lysine	ScienCell	0413
Steritop	Millipore System	SCGPT0SRE	0.22 µm pore size
Transwell insert	Corning	3401	0.4 µm pore polycarbonate filter
Trypsin/EDTA neutralization solution	ScienCell	0113
Trypsin/EDTA solution	ScienCell	0103
Immunocytochemistry
SEA BLOCK blocking buffer	ThermoScientific	37527
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody	Thermofisher	A11031	Dilution 1:500
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody	Thermofisher	A11036	Dilution 1:500
Anti-Claudin-5 primary antibody	InVitrogen	34-1600	Dilution 1:100
Anti-Desmin primary antibody	Abcam	ab6322	Dilution 1:200
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody	Dako	Z0334	Dilution 1:500
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody	Abcam	ab51090	Dilution 1:200
Anti-VE-cadherin primary antibody	Abcam	ab207732	Dilution 1:200
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody	InVitrogen	61-7300	Dilution 1:200
Normal Goat Serum	Sigma	G6767
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36962
Gene expression
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit	Macherey-Nagel	740,933,250
96 multiplate well	Biorad	HSP9601
iSCRIPT	Biorad	1708841
Sealer sheet	Biorad	MSB1001
SsoFast EvaGreen Supermix	Biorad	172-5201
Protein expression
2x Laemli Sample Buffer	Biorad	161-0737	Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay.
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody	Abcam	ab207732	Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Claudin-5 primary antibody	Abcam	ab15106	Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody	Millipore	07-1401	Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Mouse secondary antibody	Dako	P0447	Dilution 1:5000 in TBS-Tween
Anti-P-glycoprotein primary antibody	Genetex	GTX23364	Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT
Anti-Rabbit secondary antibody	Dako	P0448	Dilution 1:8000 in TBS-Tween
Anti-Transferrin Receptor primary antibody	Abcam	ab84036	Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Anti-Zona occludens-1 primary antibody	Abcam	ab216880	Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C
Criterion TGX Gel	Biorad	5678083
ECL Prime Solution	Amersham	RPN2236	Revelation solution to keep in the dark
Phospatase inhibitor cocktail 2	Sigma	P5726
Phospatase inhibitor cocktail 3	Sigma	P0044
Protease Inhibitor	Sigma	P8340
Protein Standards	Biorad	161-0373	Molecular weight markers
RIPA 10x	Millipore	20-188
TBS 10x	Biorad	1706435
TRIS-Glycine	Biorad	1610771
Tween	Biorad	1706531
BBB integrity assay
Sodium Fluorescein	Ampresco	0681	λex= 490 nm; λem= 525 nm
Elacridar	Sigma	SML0486	GF120918
FITC-Dextran 20 kDa	Sigma	FD-20S	λex= 490 nm; λem=  525 nm
Rhodamine 123	Sigma	R8004	λex= 501 nm; λem= 538 nm
SynergyTM H1	BioTek Instruments		Fluorescent multiplate reader
Nanogel Transport
Syringe	Terumo	SS+01T1	1 mL syringe
Filter	FisherScientific	15161499	0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels			The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time.