DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren
Summary
DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.
Abstract
Synapsen zijn de plaats van communicatie tussen neuronen. Neuronale circuitsterkte is gerelateerd aan synaptische dichtheid en de afbraak van synapsen is kenmerkend voor ziektetoestanden zoals depressieve stoornis (MDD) en de ziekte van Alzheimer. Traditionele technieken om synapsgetallen te onderzoeken omvatten genetische expressie van fluorescerende markers (bijv. Groen fluorescerend eiwit (GFP)), kleurstoffen die een neuron vullen (bijv. Carbocyaninekleurstof, DiI) en immunofluorescente detectie van wervelkolommarkers (bijv. Postsynaptische dichtheid 95 (PSD95)). Een belangrijk voorbehoud bij deze proxytechnieken is dat ze alleen postsynaptische veranderingen identificeren. Toch is een synaps een verbinding tussen een presynaptische terminal en een postsynaptische wervelkolom. De gouden standaard voor het meten van synapsvorming/-eliminatie vereist tijdrovende elektronenmicroscopie of arraytomografietechnieken. Deze technieken vereisen gespecialiseerde training en dure apparatuur. Verder kan slechts een beperkt aantal neuronen worden beoordeeld en worden ze gebruikt om veranderingen in een heel hersengebied weer te geven. DetectSyn is een snelle fluorescerende techniek die veranderingen in synapsvorming of -eliminatie identificeert als gevolg van een ziektetoestand of medicijnactiviteit. DetectSyn maakt gebruik van een snelle nabijheidsligatietest om naast elkaar geplaatste voor- en postsynaptische eiwitten en standaard fluorescerende microscopie te detecteren, een techniek die gemakkelijk beschikbaar is voor de meeste laboratoria. Fluorescerende detectie van de resulterende puncta maakt een snelle en onbevooroordeelde analyse van experimenten mogelijk. DetectSyn biedt meer representatieve resultaten dan elektronenmicroscopie omdat grotere gebieden kunnen worden geanalyseerd dan een beperkt aantal fluorescerende neuronen. Bovendien werkt DetectSyn voor in vitro gekweekte neuronen en vaste weefselplakken. Ten slotte wordt een methode geboden om de gegevens die uit deze techniek worden verzameld, te analyseren. Over het algemeen biedt DetectSyn een procedure voor het detecteren van relatieve veranderingen in synapsdichtheid tussen behandelingen of ziektetoestanden en is toegankelijker dan traditionele technieken.
Introduction
Synapsen zijn de fundamentele eenheid van communicatie tussen neuronen1. Veel synapsen tussen neuronen binnen dezelfde regio’s geven aanleiding tot circuits die gedrag bemiddelen2. Synapsen bestaan uit een presynaptische terminal van een neuron die neurotransmitters of neuropeptiden vrijgeeft die informatie doorgeven aan postsynaptische receptoren van een ander neuron. De som van presynaptische signalen bepaalt of het postsynaptische neuron een actiepotentiaal zal afvuren en de boodschap naar andere neuronen zal verspreiden.
Synaptopathologie, het afbreken van synapsen, ontstaat bij ziekten en aandoeningen die gekenmerkt worden door een verminderd neuraal volume, zoals de ziekte van Alzheimer en depressieve stoornis, waardoor circuits die niet meer optimaal presteren 3,4,5. Het herstellen van de synapsdichtheid ligt waarschijnlijk ten grondslag aan de werkzaamheid van mogelijke behandelingen voor deze aandoeningen. Onlangs werd bijvoorbeeld aangetoond dat toenemende synapsen ten grondslag liggen aan de gedragsmatige werkzaamheid van snelle antidepressiva6. Om mogelijke synaptopathologische behandelingen snel te screenen, hebben onderzoekers technieken nodig die snel veranderingen in synapsnummers identificeren.
De huidige methodologieën zijn ofwel tijdrovend en duur (elektronenmicroscopie, arraytomografie), of ze onderzoeken alleen postsynaptische veranderingen zonder presynaptische betrokkenheid op te nemen (wervelkolomanalyses, immunofluorescentie / colocalisatie). Kleurstoffen zoals DiI of fluorescerende eiwitten zoals GFP helpen neuronen te visualiseren en postsynaptische stekels te karakteriseren. Wervelkolomanalyse maakt echter gebruik van door onderzoekers gedefinieerde verhoudingen om morfologie te bepalen, wat de reproduceerbaarheid kan verminderen7. Verder wordt nog steeds blootgelegd hoe de verschillende wervelkolomklassen zich verhouden tot functionele synapsen8. Wervelkolomvorming kan van voorbijgaande aard zijn en kan postsynaptische plasticiteit weerspiegelen, maar deze stekels kunnen worden geëlimineerd voordat ze stabiliseren in een synaps met een presynaptisch neuron9.
Colocalisatie biedt een betere proxy voor synapsen dan wervelkolomanalyse omdat men presynaptische en postsynaptische eiwitten kan immunostainen. Synaptische eiwitten kunnen echter lage colocalisatiewaarden opleveren omdat de eiwitten naast elkaar staan en mogelijk niet consistent overlappen. Dus, omdat de eiwitten niet volledig over elkaar heen liggen, kunnen colocalisatietechnieken veranderingen in synapsvorming niet nauwkeurig meten als gevolg van deze ontbrekende informatie. Ten slotte, hoewel zowel elektronenmicroscopie (EM) als arraytomografie beelden met hoge resolutie van synapsen bieden, zijn ze tijdrovend. EM vereist verder gespecialiseerde apparatuur en onderzoekers zijn beperkt tot kleine hoeveelheden weefsel voor een bepaald experiment. Hoewel arraytomografie elegant de mogelijkheid biedt om te screenen op veel eiwitten op ultradunne secties en kan worden gecombineerd met EM10, kan deze techniek te arbeidsintensief zijn en buiten het bereik van experimenten vallen die snel moeten scannen op veranderingen in synapsvorming.
DetectSyn is een specifieke toepassing van de Duolink Proximity Ligation Assay. De PLA-test maakt de algemene detectie van eiwit-eiwitinteracties mogelijk. DetectSyn overbrugt proxy postsynaptische metingen door een fluorescerend signaal te versterken dat wordt uitgezonden door gelabelde pre- en postsynaptische eiwitten binnen 40 nm van elkaar. Als de synaptische eiwitten zich binnen 40 nm bevinden, zoals in een synaptische spleet, dan zullen de secundaire antilichamen, die DNA-sondes bevatten, hybridiseren tot circulair DNA. Dit gehybridiseerde cirkelvormige DNA drukt een fluorescerende sonde uit, die vervolgens wordt versterkt en gedetecteerd met standaard fluorescerende microscopietechnieken (zie figuur 1). Cruciaal is dat deze techniek, in tegenstelling tot EM- en arraytomografie, geen gespecialiseerde apparatuur vereist en ongeveer evenveel tijd in beslag neemt als standaard immunohistochemie. De toegankelijkheid van deze techniek stelt onderzoekers buiten onderzoeksintensieve instellingen dus in staat om deel te nemen aan synaptopathologisch onderzoek. Verder kan deze techniek veranderingen in synaptische dichtheid in meerdere hersengebieden binnen één experiment onderzoeken, waardoor een meer holistische weergave van synaptische veranderingen als gevolg van ziekte of behandeling wordt geboden.
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSyn is een snelle test die een nabijheidsligatietest gebruikt om eiwitten binnen 40 nm van elkaar te detecteren, wat de detectie van synapsvorming mogelijk maakt. Deze techniek verbetert de huidige fluorescerende assays, die alleen dienen als proxy-metingen voor synapsvorming. DetectSyn detecteert kwantificeerbare veranderingen in synaptische eiwitten gelokaliseerd binnen 40 nm, d.w.z. binnen de synaptische spleet, van elkaar. Verder is DetectSyn kosteneffectiever en kost het minder tijd dan technieken, zoals elekt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door national institutes of health NINDS R01 NS105005 (KRG) en NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), en een subsidie van FRAXA Research (CFH) en de Alzheimer’s Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Referências
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
